Name: electrochemical detection of deuterium kinetic isotope effect on extracellular electron transport in shewanella oneidensis mr-1
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1 at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).

1. Bildung von Biofilm Monolayer von S. Oneidensis MR-1 auf einer ITO-Elektrode (Abbildung 1)
Hinweis: Um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors mit anderen Mikroben zu verhindern, sollten alle Medien, Geräte und Komponenten des elektrochemischen Reaktors im Voraus sterilisiert werden. Wenn MR. S. Oneidensis -1 Zellen und konstruieren die elektrochemischen Reaktoren, alle Verfahren auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden sollten...

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	<li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance,+Physiology,+and+Regulation.">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer.">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677 (2015).</li><li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavin+as+an+Indicator+of+the+Rate-Limiting+Factor+for+Microbial+Current+Production+in+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li><li>Guo, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms.">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li><li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia.">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li><li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bound+Flavin+Model+Suggests+Similar+Electron-Transfer+Mechanisms+in+Shewanella+and+Geobacter.">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li><li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer.">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+electron+uptake+from+a+cathode+into+Shewanella+cells:+implications+for+generating+maintenance+energy+from+solid+substrates.">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475 (2017).</li></ol>

Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen - Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung...

Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln - Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c -Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.
Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist - Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass cylinder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, used as the electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE cover and base</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buthyl rubber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septa</td>
			<td>GL Science</td>
			<td>3007-16101</td>
			<td>Used as an injection port of electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin-doped oxide (ITO) electrode</td>
			<td>GEOMATEC</td>
			<td>No.0001</td>
			<td>Used as a working electrode, 5&#937;/sq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl KCl saturated electrode</td>
			<td>HOKUTO DENKO</td>
			<td>HX-R5</td>
			<td>Used as a reference electrode, &#934;0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>The Nilaco Cooporation</td>
			<td>PT-351325</td>
			<td>Used as a counter electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>244620</td>
			<td>Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthraquinone-1-sulfonate (&#945;-AQS)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A1428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavin mononucleotide (FMN)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>184-00831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>Used for defined medium (DM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-00435</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>011-03015</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-08235</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Lactate Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-4-PK</td>
			<td>Additive for kinetic isotope effect experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td>
			<td>LTI-601SD</td>
			<td>Used for precultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>NR-3</td>
			<td>Used for precultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave machine</td>
			<td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td>
			<td>LSX-500</td>
			<td>Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCV-91BNF</td>
			<td>Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge separator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td>Rotational speed upto 6000&#215;g is required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas generator</td>
			<td>Puequ CO. LTD.</td>
			<td>PNTN-2</td>
			<td>Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrometer</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td>Used for optimization of cell density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>BioLogic</td>
			<td>VMP3</td>
			<td>Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal water circulator</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>TR-1A</td>
			<td>Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>HOKUTO DENKO</td>
			<td>HS-201S</td>
			<td>Used for electrochemical experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemical detection of deuterium kinetic isotope effect on extracellular electron transport in shewanella oneidensis mr-1

Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c- Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c- Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c- Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c- Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.

Nach 25 h mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie) bildete ein monomolekularen Film Biofilm auf die Arbeitselektrode ITO Glas, zuvor durch ein Rasterelektronenmikroskop oder einem konfokalen Mikroskopie4bestätigt wurde. Der repräsentative zeitliche Verlauf der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 während einer Monoschicht Biofilmbildung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl der Strom in jeder Messung verändert, w...

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Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Probenahme und Vorbehandlung des Zahnschmelzes Carbonat für stabile Kohlenstoff und Sauerstoff-Isotopen-Analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...