Name: electrochemical detection of deuterium kinetic isotope effect on extracellular electron transport in shewanella oneidensis mr-1
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1 at JoVE.com

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק הסיוע במיוחד קידום מחקר החברה יפן של קידום המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר 24000010, 17H. 04969, ו JP17J02602, אותנו למשרד של חיל הים המחקר העולמי (N62909-17-1-2038). Y.T. היא עמיתת מחקר JSPS ונתמך על-ידי JSPS דרך התוכנית עבור המובילים לתואר שני בתי ספר (הצטיינות).

1. היווצרות ממבנה Biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 באלקטרודה איטו (איור 1)
הערה: כדי למנוע את הזיהום של הכור אלקטרוכימי עם חיידקים אחרים, כל התקשורת, סככה, ו רכיבים של הכור אלקטרוכימי צריכים לעקר מראש. כאשר באמצעות תאים oneidensis ס מר-1, בניית הכורים אלקטרוכימי, כל הה?...

<ol>
	<li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance,+Physiology,+and+Regulation.">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li><li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants.">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li><li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+voltammetry+of+biofilms+of+wild+type+and+mutant+Geobacter+sulfurreducens+on+fuel+cell+anodes+indicates+possible+roles+of+OmcB,+OmcZ,+type+IV+pili,+and+protons+in+extracellular+electron+transfer.">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li><li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+identification+of+direct+electron+transfer+from+Shewanella+oneidensis+MR-1+to+electrodes+via+outer-membrane+OmcA-MtrCAB+protein+complexes.">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li><li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cyclic+voltammetry+to+investigate+enhanced+catalytic+current+generation+by+biofilm-modified+anodes+of+Geobacter+sulfurreducens+strain+DL1+vs.+variant+strain+KN400.">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li><li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bug+juice:+harvesting+electricity+with+microorganisms.">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li><li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron(III)+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1.">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+biofilm+imaging,+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy.">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li><li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes.">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li><li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes.">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li><li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese(IV)+and+Iron(III)+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1.">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li><li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Electron+Transport+Scarcely+Accumulates+Proton+Motive+Force+in+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li><li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex.">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li><li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport.">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li><li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions.">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li><li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms.">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li><li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells.">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li><li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds.">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li><li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth.">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071 (2014).</li><li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones.">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li><li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer.">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677 (2015).</li><li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavin+as+an+Indicator+of+the+Rate-Limiting+Factor+for+Microbial+Current+Production+in+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li><li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Cr(VI)+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators.">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li><li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spectrophotometric+Method+for+Monitoring+Tactic+Responses+of+Bacteria+under+Anaerobic+Conditions.">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li><li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li><li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li><li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+properties+of+cytochrome+c+adsorbed+on+self-assembled+monolayers:+A+probe+for+protein+conformation+and+orientation.">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li><li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes.">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li><li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms.">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li><li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia.">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li><li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bound+Flavin+Model+Suggests+Similar+Electron-Transfer+Mechanisms+in+Shewanella+and+Geobacter.">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li><li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer.">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li><li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+Extracellular+Electron+Transfer+by+Alternative+Redox-Active+Molecules+to+Riboflavin+for+Outer-Membrane+Cytochrome+c+of+Shewanella+oneidensis+MR-1.">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li><li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+electron+uptake+from+a+cathode+into+Shewanella+cells:+implications+for+generating+maintenance+energy+from+solid+substrates.">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475 (2017).</li></ol>

שלנו assay אלקטרוכימי של תאים שלמים יש כמה יתרונות טכניים לעומת חלבון אלקטרוכימיה. בעוד טיהור חלבון דורש הליכים גוזלת זמן רב שלבי, השיטה כולה-תא שלנו לוקח יום אחד של ביופילמים עצמית מאורגן לאחר תרבית תאים. כדי להשיג את האינטראקציה יציב בין אום c- Cyts האלקטרודה, אנחנו זקוקים רק עיקור, ניקוי ...

בטכניקות אלקטרוכימיות לאפיין ישירות חלבון חמצון-חיזור תא החיידק ללא פגע לאחרונה הופיעו מאז הגילוי להפחתת מתכת זני חיידקים, כגון oneidensis ס מר-1 או Geobacter sulfurreducens PCA, אשר יש מתחמי ציטוכרום c-type הממברנה החיצונית (OM c-Cyts) נחשפים תא חיצוני1,2,3,4,5. אום c- Cyts מתווכים התחבורה אלקטרונים בשרשרת הנשימה סובסטרטים מוצק ממוקם extracellularly. העברה זו נחשבת אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET)1,6 , תהליך קריטי עבור מנרב המתעוררים, כגון חיידקים בתאי דלק6. לכן, כדי להבין קינטיקה EET הבסיסית של מנגנונים ואת זיקתה פיזיולוגיה מיקרוביאלי, אום c -Cyts נחקרו באמצעות תאים שלמים אלקטרוכימיה4,7, בשילוב עם מיקרוסקופ 8 , 9,10,ספקטרוסקופיה11וביולוגיה מולקולרית2,4. לעומת זאת, שיטות כדי לחקור את השפעת התחבורה הקטיון הקשורים EET, למשל, פרוטונים, על EET קינטיקה בתאים חיים בקושי הוקמו, למרות פרוטון תחבורה מעבר ממברנות חיידקי יש תפקיד קריטי איתות, הומאוסטזיס ואנרגיה ייצור12,13,14. בהווה ללמוד, נתאר טכניקה כדי לבחון את השפעת התחבורה פרוטון-קינטיקה EET בתא oneidensis ס מר-1 באמצעות כל-תא אלקטרוכימי מדידות, המחייב את הזיהוי של הצעד הגבלת קצב חיידקים הנוכחי הפקה15.
דרך ישירה אחת כדי להעריך את התרומה של פרוטון הובלה על EET המשויך הוא אפקט קינטי איזוטופ דאוטריום (KIE). KIE הוא מקהים השינוי ב קינטיקה העברת אלקטרונים על החלפת פרוטונים עם יונים דאוטריום, אשר מייצג את השפעת התחבורה פרוטון אלקטרון העברה קינטיקה16. התיאוריה של KIE עצמה הוכח גם באמצעות מדידות אלקטרוכימי עם אנזימים מטוהרים17. עם זאת, מאז הייצור הנוכחי ב ס oneidensis מר-1 היא תוצאה של תהליכים מגוונים, המשתנות מרובים,18, אחד יכול פשוט לזהות EET כתהליך הגבלת קצב. כדי לבחון את KIE על פרוטון תחבורה תהליכים בשילוב עם EET, עלינו לוודא כי ההפקה הנוכחית חיידקים מוגבל על ידי אלקטרון תחבורה באמצעות אום c- Cyts אל האלקטרודה. למטרה זו, החלפנו את הפתרון supernatant בינונית טריים המכילים ריכוז גבוה של חומצת החלב כמו תורם אלקטרון pH אופטימלי, בתנאי טמפרטורה לפני המדידה KIE; החלפת הזה שימש שני תפקידים: (1) קצב התהליכים המטאבוליים במעלה בהשוואה EET לבין (2) הושמט התאים שחיה תגובת שיקוע שוחררו את biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 ב (אלקטרודה העבודה אינדיום בדיל-מסטול אוקסיד (ITO) אלקטרודה). פרוטוקול מפורט הציג מיועדת לסייע מתרגלים חדשים לשמור, לאשר כי התהליך EET הוא השלב שקובעים שיעור.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass cylinder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, used as the electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE cover and base</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buthyl rubber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septa</td>
			<td>GL Science</td>
			<td>3007-16101</td>
			<td>Used as an injection port of electrochemical reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium tin-doped oxide (ITO) electrode</td>
			<td>GEOMATEC</td>
			<td>No.0001</td>
			<td>Used as a working electrode, 5&#937;/sq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl KCl saturated electrode</td>
			<td>HOKUTO DENKO</td>
			<td>HX-R5</td>
			<td>Used as a reference electrode, &#934;0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>The Nilaco Cooporation</td>
			<td>PT-351325</td>
			<td>Used as a counter electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>244620</td>
			<td>Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthraquinone-1-sulfonate (&#945;-AQS)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A1428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavin mononucleotide (FMN)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>184-00831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td>Used for defined medium (DM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-00435</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>011-03015</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>346-08235</td>
			<td>Used for DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Lactate Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dichkinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (D, 99.9%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-4-PK</td>
			<td>Additive for kinetic isotope effect experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td>
			<td>LTI-601SD</td>
			<td>Used for precultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>NR-3</td>
			<td>Used for precultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave machine</td>
			<td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td>
			<td>LSX-500</td>
			<td>Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCV-91BNF</td>
			<td>Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge separator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td>Rotational speed upto 6000&#215;g is required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas generator</td>
			<td>Puequ CO. LTD.</td>
			<td>PNTN-2</td>
			<td>Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrometer</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td>Used for optimization of cell density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>BioLogic</td>
			<td>VMP3</td>
			<td>Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal water circulator</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>TR-1A</td>
			<td>Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>HOKUTO DENKO</td>
			<td>HS-201S</td>
			<td>Used for electrochemical experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemical detection of deuterium kinetic isotope effect on extracellular electron transport in shewanella oneidensis mr-1

ישיר זיהוי אלקטרוכימי של c-הקלד מתחמי ציטוכרום מוטבע בתוך הממברנה החיצונית חיידקי (הממברנה החיצונית c-הקלד ציטוכרום מתחמי; אום c- Cyts) יש לאחרונה הופיעו כשיטה הרומן השלם-תא אנליטי לאפיין התעבורה חיידקי אלקטרונים בשרשרת הנשימה אל החוץ תא, המכונה התעבורה אלקטרון חוץ-תאית (EET). בזמן מסלול וקינטיקה של זרימת אלקטרונים במהלך התגובה EET נחקרו, שיטה אלקטרוכימי תאים שלמים כדי לבחון את השפעת התחבורה הקטיון המשויך EET לא טרם הוקם. במחקר הנוכחי, דוגמה טכניקה הביוכימי לבחון את דאוטריום איזוטופ קינטי (KIE) על EET דרך אום c- Cyts באמצעות מודל ומה איתי, מר Shewanella oneidensis -1, הוא תיאר. ניתן להשיג את KIE על תהליך EET אם EET דרך אום c- Cyts משמש הצעד הגבלת קצב הייצור הנוכחי מיקרוביאלי. לשם כך, לפני התוספת של D2O, הפתרון supernatant הוחלף טריים המדיה המכילה כמות מספקת של התורם אלקטרון כדי לתמוך הקצב של תגובות חילוף החומרים במעלה הזרם, וכדי להסיר תאים פלנקטוניים מדים טפט biofilm על האלקטרודה עבודה. שיטות אלטרנטיביות כדי לאשר הגבלת הקצב את שלב הייצור הנוכחי מיקרוביאלית כמו EET דרך אום c- Cyts מתוארים גם. הטכניקה שלנו של assay אלקטרוכימי תאים שלמים על חקירת קינטיקה תחבורה פרוטון יכול להחיל על זני חיידקים אחרים electroactive.

לאחר 25 h של פוטנציאל היישום ב- +0.4 V (לעומת היא), ממבנה biofilm טפט הוקמה ב האלקטרודה עבודה של זכוכית ITO, אשר אושר קודם לכן ע י או של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה או מיקרוסקופיה קונפוקלית4. המסלול הפעם נציג של הייצור הנוכחי של ה- S. oneidensis מר-1 במהלך היווצרות ממבנה biofilm ?...

Watch this Scientific Journal Video about Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1 at JoVE.com

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

כאן אנו מציגים פרוטוקול של כל תא אלקטרוכימי ניסויים ללמוד את התרומה של פרוטון תחבורה לקצב התחבורה אלקטרון חוץ-תאית באמצעות cytochromes הממברנה החיצונית מתחם Shewanella oneidensis מר-1.

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

The overall goal of this protocol is to observe the contribution of proton transport to the rate of bacterial extracellular electron transport by the detection of the deuterium kinetic isotope effect. Our method reveals the impact of proton transport on the kinetics of extracellular electron transport or EET from bacteria to an electrode via outer membrane c-type cytochromes. Our assay reflects the native proton management in EET because we used living bacteria rather than purified enzyme.However, our challenge was to remove the noises from other cellular processes. The deuterium kinetic isotope effect termed as KIE is one of the best technique to examine the contribution of proton transport on the associated electron transport process. To grow Shewanella MR-1 cells, transfer one colony of the cells grown on an agar plate into 15 milliliters of LB medium.Grow the cells at 30 degrees Celsius for 24 hours in aerobic conditions with shaking at 160 rpm. Centrifuge the cell suspension at 6, 000 times gravity for 10 minutes. Then, resuspend the resultant cell pellet in 15 milliliters of Defined Medium, supplemented with 10 millimolar lactate as the source of carbon and 0.5 grams per liter yeast extract as trace elements for the cells.After further cultivating the cell suspension aerobically at 30 degrees Celsius for 12 hours with shaking at 160 rpm, centrifuge again at 6, 000 times gravity for 10 minutes. Wash the resultant cell pellet twice with DM medium by centrifugation for 10 minutes at 6, 000 times gravity before the electrochemical experiment. To construct a three-electrode electrochemical reactor, put an ITO substrate as the working electrode at the bottom of the reactor.Subsequently, insert a glass cylinder and a polytetrafluoroethylene cover and insert a platinum wire as the counter-electrode. Then, insert a silver chloride electrode into the reactor as the reference electrode. Next, add four milliliters of DM supplemented with 10 millimolar lactate and 0.5 grams per liter yeast extract into the electrochemical reactor.After confirming that there is no leakage from the electrochemical reactor, flow the nitrogen gas into the electrochemical reactor over 20 minutes to maintain anerobic conditions inside the electrochemical reactor. Connect the electrochemical reactor to a potentiostat and apply a positive 0.4 volts to the ITO electrode, keeping the temperature of the electrochemical reactor at 30 degrees Celsius using an external water circulation system. To perform electrochemical cultivation, first adjust the cell density of the suspension to an optical density of 1.43 at 600 nanometers with DM supplemented by 10 millimolar lactate and 0.5 grams per liter yeast extract.Add 0.3 milliliters of the cell suspension into the electrochemical reactor through the injection port using a syringe. The OD 600 in the reactor changes to 0.1. Continue the potential application at positive 0.4 volts to the ITO electrode for 25 hours.Stop the potential application and disconnect the electrochemical reactor from the potentiostat and the water circulation system. Flow the nitrogen gas into a bottle containing DM with 10 millimolar lactate over 20 minutes to remove oxygen from the medium. Now, extremely slowly and gently, remove all the supernatant from inside the electrochemical reactor using a syringe under flowing nitrogen gas.Then, add four milliliters of fresh DM containing 10 millimolar lactate using a syringe. Slant the electrochemical reactor to remove all of the supernatant on the wall of the reactor. Repeat these steps three times in total.Stop the gas flow and connect the electrochemical reactor to the potentiostat again, applying a positive 0.4 volts to the ITO electrode at 303 Kelvin. Confirm that the current production from a monolayer biofilm of Shewanella MR-1 is stable and does not increase rapidly. If the current increases steeply, wait until the current stabilizes with a 5%increase over 10 minutes.Extremely slowly and gently, add 40 microliters of anoxic 50 volume percent D2O into the electrochemical reactor using a syringe such that the concentration is 0.5 volume percent D2O in the reactor. To prevent damage to the biofilm by D20 addition, inject the D2O dropwise. Wait for the current to stabilize and subsequently add the D2O up to 4.4 volume percent to obtain the KIE value, which is the ratio of current production and presence of D2O and H2O.Check the effect of the same volume of H2O addition on the current production. Here, the solid line is the representative result for the microbial current change induced by D2O addition. Addition of D2O sharply decreased the microbial current within 10 seconds, while H20 had almost no current decrease as shown with the dotted line.To confirm that the observed current decrease by D2O is attributable to electron transport through outer membrane cytochromes, a diffusing electron mediator was used. Here addition of 100 micromolar alpha-AQS enhanced the current production by more than five times and the current production remained unaffected by D2O addition. These results indicate that the kinetics of the metabolic reactions are fast enough so that the extracellular electron transfer process is rate-limiting.An alternative method for assessing this is the addition of the flavin molecule into the electrochemical reactor. An instant anodic current increase by flavin addition indicates rate-limitation by the electron transport process via outer membrane cytochromes. After watching this video, you should have a good understanding of how to examine the kinetic isotope effect on the extracellular electron transport process.The most critical point to successfully obtain the kinetic isotope effect is to clarify and confirm the condition where the electron transport through the outer membrane cytochromes limits the rate of current production. In this video, we introduced two methods to confirm this condition, observation of current change by addition of flavin and by addition of diffusing extra mediator, such as alpha-AQS. Once the rate-limitation is confirmed, this system can be used not only for the deuterium experiment but also for the biochemical characterization of outer membrane cytochromes.Furthermore, this protocol could be applicable to examining other electroactive microbes, as long the extracellular electron transport process is rate-limiting. Our methodology provides a basic and general technique to investigate the extracellular electron transport process via outer membrane cytochromes in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

דגימה רעלני של זגוגית השן פחמתי פחמן יציב וניתוח איזוטופ החמצן

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...