Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך פרס הקריירה (גרנט מספר DBI-1253293); במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענק מספרים HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); והתוכנית הגנה מתקדמת מחקר פרויקטים סוכנות חיים יציקה (חוזה מספרים HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol>
	<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients.">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li><li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+islands+in+bacterial+pathogenesis.">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li><li>Mart&#237;nez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection:+pathogenicity+epidemicity,+and+antibiotic+resistance.">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+for+single+cells.">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li><li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing.">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics.">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+labeling+(Hi-SCL)+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics.">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li><li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing.">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing.">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784 (2016).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding.">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li><li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions.">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li><li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota.">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li><li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering.">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).</li><li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics.">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).</li><li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun.">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment.">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).</li><li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes.">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li><li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+metagenomic+sequences:+methods+and+challenges.">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing.">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).</li><li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+helix+in+a+haystack:+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics.">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li></ol>

הפטנטים הנוגעים זרימת עבודה זו עשוי להיות מורשה ביו המשימה, של אבטה רבי איזה אדם הוא מניות.

SiC-seq microfluidic זרימת העבודה יוצרת נתונים רצף הגנום בתא יחיד מתוך אלפי תאים חיידקיים. ברקודים דיגיטלי משולבים לתוך הגנום של תאים microgel-אנקפסולציה מאפשרים סיליקו deconvolution של הגדרות נתונים לקבוצות הקריאות לבר-קוד שמקורם באותו התא. ניסוי שליטה עם קהילה מיקרוביאלית של ההרכב ידוע יש צורך להעריך את הטוהר של הקבוצות ברקוד. חלק גדול של קבוצות נמוך-טוהר מציין כי שיעור עיטוף התא הוא גבוה מדי או שיש זיהום משמעותי droplet המתרחשים במהלך השלבים בעיבוד microfluidic. לפי נתוני פואסון, ברקודים של תאים צריך להיות אנקפסולציה ביחס למטרה של חלקיק 1 עבור כל 10 טיפות להגביל את הקצב של אירועים מרובים כימוס פחות מ 5% של כל טיפות שאינן ריקות. שיעור עיטוף גבוה יותר מאשר זה מגביר את שערי doublets באופן אקספוננציאלי, אז האימות של היחס כימוס במהלך תהליך dropmaking הוא בעל חשיבות קריטית. המשתמשים צריכים להיות זהירים במיוחד הסגירות של תאים מרובים ב- microgel יחיד כי קריאות של תאים שונים שיתוף אותו רצף ברקוד לא יכול להיות bioinformatically מופרדים. במקרה שתא 1 מקבל 2 ברקודים שונים, טוהר קבוצה ברקוד הוא מושפע למרות שפע מדדים מוטים בעת ספירה לפי רצף ברקוד.
זיהום צולב droplet שעלולים להתעורר גם בשל תנאי המיזוג שיוצרת. במהלך מבצע מוצלח, המכשיר המיזוג microfluidic (איור 5) ניתן לשייך מכאנית ופיקודית droplet ברקוד 1 עם 1 microgel ונפח של ריאגנט PCR. Non-אידיאלי זרימה המחירים יביא droplet זיווג-לא נכונים ratios: ברקוד 1 יכול להיות משויך עם 2 microgels, למשל. כל המחירים הזרימה הרשום בפרוטוקול נועדו להיות הערכות וצריך יותאם בהתאם סטיות במידות גאומטריה ו רביב המכשיר. למשתמשים בעלי גישה למצלמות עם יכולות הקלטה במהירות גבוהה (> מסגרות לשנייה 10,000) עליך לוודא המיזוג droplet נכונה בתחילת ובמהלך הפעולה microfluidic. משתמשים ללא גישה מצלמת מהירות גבוהה ניתן לאסוף את נפח קטן של הפלט הממוזג, באופן ידני למדוד את גודל droplet תחת מיקרוסקופ. גודל droplet צריך להיות אחיד: עודף של ברקודים שלא מוזג או טיפות microgel מציין כי שיעור reinjection צריך להיות מופחת בהתאם.
מספר כללי זהירות יש לנקוט בעת טיפול microgels ו- microdroplets כדי לשמר את שלמות שלהם. Microgels, למרות מכנית חזקה, חייב להיות מספיק מקורר לפני שבירת ושטיפת צעדים כדי להבטיח gelation מלאה. Microgels שאינה כדורית הם סימן לכך agarose לא היה נתון מספיק זמן כדי לחזק. כאשר הכביסה microgels, לסובב את המתלים למטה במהירויות הנדרשים כדי למנוע אובדן של המוצר. Agarose הידרוג בעל אינדקס השבירה מקרוב ההתאמה של מים, ייתכן שתתקשה לראות צינור22, כך שמשתמשים בקפידה צריך לזהות את הגבול ג'ל נוזלי לפני השאיפה. טיפות מים בתוך שמן רגישים coalescence על ידי הצטברות של כוחות סטטיים23 על כפפות מעבדה, אבובים. מסיבה זו, אנו ממליצים להתייחס כל הקווים reinjection עם אקדח אנטי סטטי לפני לקרקע המשאבה וטעינה של מזרקים reinjection droplet בידיים חשופות. טיפות התמזגו גדולים ניתן להסיר על ידי סובבים לאיטם את אמולסיות בתוך מזרק ידנית כ רפה בעברית את טיפות גדולות יותר, אשר לצבור קרוב לצמרת עקב שלהם כוח גדול יותר קליל.
SiC-seq היא הטכנולוגיה הראשונה כדי להדגים את רצף הגנום בתא יחיד של > 50,000 תאים חיידקיים. פלטפורמה זו יתרונות משמעותיים בהתפוקה על גישות קיימות, ומאפשרת דגימה עמוק יותר של קהילות מיקרוביאלי הטרוגנית. עד כה, microfluidic טכנולוגיות רצף הגנום בתא יחיד המועסקים microchambers9 ו- microwells24 לתא הבידוד, הגברה, אך עם תפוקות בטווח של רק עשרות מאות תאים. זרימה המיון של תאים בודדים לתוך5,wellplates6 דורש אין מכשור microfluidic מיוחדים אך בעל תפוקה נמוכה באופן דומה. בהתחשב בכך דגימות קרקע ומים מהסביבה יש בדרך כלל הבדלים אלפא של > 1,000-המין רמה25,26, SiC-seq יש יתרון מאוד בזכות יכולתה לדגום מספר גדול בהרבה של אורגניזמים. SiC-seq זרימת העבודה היא יכולת הסתגלות תא תשומות מעבדה התרבות, הסביבה הטבעית או גוף חי. דגימת תאים צריך רק להיות בתרחיף, ללא חלקיקים גדולים (> 10 מיקרומטר) לאבן המתאימה microfluidic אנקפסולציה. לדוגמה, שיטת הוחל בעבר למדגם של מי-ים באמצעות סדרה של שטיפת וסינון צעדים כדי לעבד מראש את התאים לפני כימוס17.
פרוטוקול SiC-seq מייצר כמות רצף נתונים דליל יחסית של כל תא ותא, לא יכול להיות מתאים עבור כל היישומים. כמה אלגוריתמים ביואינפורמטיקה כגון דה נובו הגנום הרכבה או משתנה נוקלאוטיד יחיד (SNV) מתקשר דורשים במעמקי כיסוי גבוה יותר לעבוד ביעילות. במקום זאת, ברקוד קבוצות יכולים להיות מקובצים באשכולות סיליקו מאת בטקסונומיה שיטות binning27 כך אלגוריתמים יכול להיות מיושם על קבוצות גדולות של קריאות. היעילות barcoding הכוללת נמוכה יחסית של זרימת העבודה SiC-seq יכול גם להציג אתגרים במקרים בהם הזמינות של המדגם קלט נמוכה. SiC-seq מסתמך על צעד כימוס ברקוד פואסון-מבוזרות, לכן כ- 10% של התאים מקבלים ברקוד מולקולרית, הם מוגבר במהלך השלב הסופי ספריית הכנה. אמנם זה להשוות ערכות barcoding מבוסס-microdroplet10, משתמשים העובדים עם דגימות תאים יקר שיש קושי להשיג את התשואה ספריית נאותה של רצף, ייתכן שתצטרך להגדיל את מספר מחזורי PCR בגמר שלב הגברה. פתרון פוטנציאלי נוסף עבור משתמשים בעלי מומחיות microfluidic הוא למיין טיפות ברקוד חיובי לאחר השלב ה-PCR דיגיטלי, ובכך להביא את היעילות הכוללת barcoding > 85%28.
כיוון עתידי פוטנציאלי SiC-seq טכנולוגיה מתאימה את זרימת העבודה עבור שימוש עם תאי יונקים, לסלול את הדרך החדשה מחקרים קליניים של תא בודד. לדוגמה, ניתוח של וריאציית עותק מספר בין אחד סרטן תאים מאי לקדם את ההבנה שלנו של התפקיד של הטרוגניות הפתולוגיה סרטן2. לחלופין, שילוב SiC-seq עם שיטות קיימות בדיקה ולהעשיר רצפי DNA של עניין29 תאפשר את רצף תא בודד יישוב של subpopulations או זנים נדירים של תאים. עם דגימות סביבתיים, הגנים בתוך מסלול מטבולי ידוע יכול להיות ממוקד וניתח התרגום לצד השכנה גנים לזהות את הרומן איי גנומית. מ בתוך סביבה הפונדקאי. האנושי, חיידקים פתוגניים כייל נמוך יכול להיות מבודד ודוגמאות וסודרו ברמת תא בודד כדי לבחון יותר מקרוב את מקורם genotypic של התקפה אלימה.

הגנום משמשת מעין טביעת אצבע של זהות הסלולר ותפקוד, המכיל מכלול של אורגניזם של קידוד פוטנציאל. הבנה של ביולוגיה תאית ברמת הגנום יכול להסביר את המגוון פנוטיפי שנצפה בתוך אוכלוסיות הטרוגניות התא. הטרוגניות זו ניכר במערכות ביולוגיות, ויש לו השלכות רחבות על מחלה ובריאות האדם. לדוגמה, ג'ין עותק מספר וריאציות בין תאים סרטניים מקושרים את התפתחות והתפשטות של סרטן1,2. זיהומים חיידקיים, פתוגניות האיים נוכח חלק קטן של הגנום יועבר בצורה אופקית, להוביל לשגשוג חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה3,4. אתגר ראשוני בלימוד הגנום ברמת תא בודד הוא כמויות נמוכות של DNA זמינים, כמו גם את הצורך לנתח את אלפי תאים כדי לדגום את המגוון המלא של אחרים. מסיבות אלו, מגבלות תפוקה ניסיוני יש הפריע את האפקטיביות של מחקרים מתא בודד, ממתח תוצאות לכיוון תאי הנפוץ ביותר. בידוד תא בודד טכניקות כגון זרימת מיון5,6, מלקחיים אופטיים7, embedment בתפזורת ג'לים8ולאחר מיקרופלואידיקה9 מסוגלים עיבוד מאות תאים עבור רצף; עם זאת, זה מייצג רק חלק קטן של דוגמאות לרוב. שיטה של רצף הגנום בתא יחיד עם תפוקה גבוהה במידה ניכרת תאפשר עמוק יותר ושלמה יותר פרופיל של אוכלוסיות תאים, ובכך הבהרת בתפקיד של גיוון genotypic בתוך קהילות אלה.
מיקרופלואידיקה droplet מאפשר מניפולציה תפוקה גבוהה של תאים, ריאגנטים הביולוגי בתוך מיליוני כורים בקנה מידה picoliter. עד כה, microdroplet טכנולוגיות השתמשו ללמוד דפוסי ביטוי דיפרנציאלי בין תאים ברקמות הטרוגנית10,11,12, עמוק רצף מולקולות ארוכות13,14 ,15, וניתוחים התנהגות כרומטין immunoprecipitation רצף (צ'יפ-seq) על תאים בודדים16. אכן, microdroplets מסוגלים תפוקה גבוהה, ממודר פעולות, שהופך אותם נוטה יישומים גנומיקה תא בודד. פיתוח טכנולוגיה זו מציג אתגרים טכנולוגיים ייחודיים משלו, עם זאת. תאים חייב להיות lysed, טהור, מוגבר עם הטיה מינימלי, לאוכלוסיות בצורה אחידה דגימת תאים. בנוסף, בשונה polyadenylated תעתיקים mRNA בתאים בתרבית של, יש מוטיב מולקולרי דומה אין הגנום כדי להקל על לכידתו של חומצות גרעין היעד. מסיבות אלו, רצף הגנום בתא יחיד היה קשה ליישם ב microdroplet פלטפורמות.
בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גישת שדווחה בעבר microfluidic תא בודד מסוגל רצף הגנום של עשרות אלפי תאים ניסוי יחידה17. באמצעות טכנולוגיה זו, הנקראת SiC-seq, תאים חיידקיים נמצאים במארז בקנה מידה מיקרון hydrogels בנפרד lysed, tagmented, ואת התמזגה עם microdroplet המכיל ברקוד oligonucleotide ייחודי, אשר הוא משולבים על גבי DNA גנומי של התא דרך חפיפה בודדת סיומת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). Hydrogels לשמש מיכלים מבודדים שבהם DNA גנומי גבוהה משקל מולקולרי הוא sterically עטוף, ומאפשר מולקולות קטנות יותר כגון דטרגנטים, אנזימים lytic כדי לגשת ולטהר את הדנ א לפני barcoding18. פרוטוקול זה מעבד > 50,000 תאים בודדים תוך מספר שעות, וכתוצאה מכך ספרייה לבר-קוד מוכן רצף. בעקבות הרצף, הקריאות הם demultiplexed לפי הרצף תא בודד ברקוד שלהם, וכתוצאה מכך dataset מכיל מיליוני קוראת, כל אחד עם מדד הסלולר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

טכנולוגיות רצף עברו שינוי פרדיגמה של צובר לרזולוציה תא בודד בתגובה הבנה המתפתחת של התפקיד של הטרוגניות הסלולר במערכות ביולוגיות. עם זאת, תא בודד רצף של אוכלוסיות גדולות יש כבר הקשו על ידי מגבלות בעיבוד הגנום עבור רצף. בנייר זה, אנו מתארים שיטה של רצף הגנום בתא יחיד (SiC-seq) אשר משתמשת מיקרופלואידיקה droplet כדי לבודד, להגביר, ברקוד הגנום של תאים בודדים. תא אנקפסולציה בתוך microgels מאפשר טיהור ממודר tagmentation של ה-DNA, בזמן מיזוג microfluidic זוגות ביעילות כל הגנום עם ברקוד ייחודי oligonucleotide תא בודד, ומאפשר > 50,000 תאים בודדים היה לסדרם לכל הפעלה. רצף הנתונים demultiplexed על ידי ברקוד, יצירת קבוצות של קריאות שמקורם תאים בודדים. כשיטת תפוקה גבוהה ולא נמוכה-הטיה של תא בודד רצף, SiC-seq יאפשר מגוון רחב יותר של גנומית מחקרים מכוון אוכלוסיות מגוונות תא.

SiC-seq ניסיוני זרימת העבודה מכיל 3 מכשירים microfluidic PDMS מפוברק באמצעות הליך ליתוגרפיה רך (איור 1). Dropmaker זרימה ושיתוף (איור 3 א) יוצר מיקרומטר 25 של טיפות ברקוד דיגיטלי עבור תיוג הדנ א עם מזהה ייחודי של תא בודד. Oligonucleotides הברקוד מורכב bp 15 מנוונת רצף ולצדו PCR ידיות הגברה (טבלה 2, בר פריימר). הברקודים נמצאים מדולל כדי ריכוז femtomolar כדי להשיג את עטיפת מולקולה בודדת, ולקבל כל טיפות fragment(s) ברקוד או 0 או 1. טיפות המכילות ברקוד הם מוגבר, מניב עותקים רבים של גדילי כפול הברקוד amplicons. כתם חומצת גרעין משמש כדי לוודא הגברה מוצלחת ולכמת את קצב עיטוף של השברים ברקוד (איור 4B). Microgels הנוצרים על-ידי שיתוף זורם השעיה תא החיידק, ג'ל agarose מותכת במחירים שווים זרימה (איור 2 א). Agarose מוכן-פעמיים הריכוז הסופי הרצוי, כמו תהליך dropmaking זרימה משותפת ביעילות מדללת את הפתרונות מימית בפקטור של 2. כפי agarose מתקררת, הוא עפור לתוך microgel בקוטר 25 מיקרומטר שיתפסו נפח כדורית של ה-droplet.
סדרה של צעדים רוחצים את פירוק מטהרת את הדנ א הגנומי ב microgels (איור 2B) גבוהה משקל מולקולרי. לאחר שבירת את אמולסיות, שוטף מימית מתבצעות בכמויות גדולות כדי לדלל את עקבות ממיסים אורגניים אשר יכול לעכב את הטיפולים אנזימטי במורד הזרם. Microgels שטף שנצפו תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את קצב עיטוף תא (איור 4A). קוקטייל של אנזימים עם פעילות lytic רחב נוסף המתלה microgel לעכל את קירות התא של חיידקים, חיידקים האיקריוטים19. טיפול השנייה עם Proteinase K ודטרגנט ונמחקות החלבונים, solubilizes שאריות תאים.
Tagmentation של ה-DNA מטוהרים מתבצעת טיפות כדי למנוע זיהום צולב פוטנציאלי הנובע פעפוע של tagmented קטן שברי DNA בין microgels18. מכשיר כימוס droplet (איור 3B) compartmentalizes כל microgel עם אנזים מאגר ו tagmentation, אשר בו זמנית קטעים כפול גדילי DNA בעת גם "מסמן" אותה עם oligonucleotide שנטענו מראש20. Microgels נטענים לתוך טיפות כמו חלקיקים לזינוק, להשגת המחירים כימוס מתקרב microgel 1 עבור כל טיפה עם כמה doublets21 (איור 4C).
בשלב הסופי של זרימת העבודה microfluidic (איור 2C), התקן מבצע פעולה המיזוג זוגי המשלב טיפה ברקוד 1 טיפה המכילות microgel 1, את הגברה התמהיל בתהליך בן שני שלבים מבוקרים. ראשית, droplet המכיל PCR ריאגנט לזווג, התמזגה עם טיפה ברקוד באזור שמוצג צהוב (איור 5). אלקטרודות מים מלוחים בערוץ microfluidic לייצר מעבר צבע גבוהה שדה חשמלי אשר מפעיל את המיזוג droplet. באופן דומה, ה-droplet הממוזג הראשון הוא מזווג עם טיפונת microgel, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. טיפות נאספים, תרמי רכב על אופניים מחוץ שבב ב סיומת יחיד-חפיפה (SOE) PCR. בקצות משלימים וחופפים הברקוד ואת הדנ א הגנומי tagmented מאפשרים היתוך הגברה מעריכית של בונה לבר-קוד רק כראוי.
רצף הנתונים קודם המסוננות לפי איכות קריאה וכי אז מנותח על ידי קיבוץ של הקריאות לפי הרצף שלהם 15-bp תא בודד ברקוד. עבור קבוצה ברקוד להיחשב חוקיים, עליה להכיל מספר מינימלי של קריאות; סף זה מגביל את הניתוח לתאים עם כמות רצף נתונים שימושי ומסירה את הברקוד מוטציה ב- PCR "יתומים" ערכת הנתונים. במדגם זה לרוץ, הסכום המינימלי מוגדר כ- 7.5 קילו לכל קבוצה (50 קריאות של 150 bp כל). היסטוגרמה של הסעיפים ברקוד לעומת גודל הקבוצה מראה כי חלק ניכר של הקבוצות ברקוד תקף מעל גודל הסף (איור 6A).
בניסוי שליטה שבהן ידוע הרכב הקהילה מיקרוביאלי, משמשים את הטוהר ואת השפע היחסי מדדים כדי להעריך את איכות משחק ההמ-SiC לרוץ. . הנה, קהילה 10-תא סינתטי של חיידקים גראם שליליים 3, 5 חיידקים גראם חיוביים, שמרים 2 הוא ניתח. הטוהר של קבוצת ברקוד נתון מוגדר מספר קריאות מיפוי הגנום הנפוץ ביותר בקבוצה מחולק על ידי המספר הכולל של קריאות בקבוצה. הרוב המכריע של הקבוצות ברקוד יש purities גדול מ- 0.95 (איור 6B). שפע יחסי של סוגי תאים מחושבת על ידי ספירת את קריאות raw, על ידי ספירת קבוצות ברקוד, שבו הקבוצות מוקצים סוג התא המתאים הקונצנזוס הקריאות חבר שלה (איור 6C). השפע של קריאות וקבוצות ברקוד לעקוב אחר בפרופורציות שווה בערך, המציין כי הם להיות שנדגמו האוכלוסיות תא כזה כי מינים מסוימים לא כלולים בקבוצות קטנות או גדולות פרופורציה ברקוד. התוויית בסקירה צבירה של קבוצות ברקוד כל בזן אחד מציין כיסוי גבוהה ברחבי הגנום כולו, עם אזורי הנשירה כמה או לא (איור 7). ניתנת לאימות כמקורית האחידות של כיסוי עם התפלגות שכיחויות של ערכים כיסוי מנורמל, עם ערכים רוב ממורכזת סביב הממוצע (איור 7, הזחה).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> איור 1 : ייצור של microfluidic התקנים על ידי פוטוליתוגרפיה. (א) מאסטר תבניות עם תכונה אחת לגובה מיוצרים על ידי סחרור ציפוי שכבה של סו-8 photoresist על גבי רקיק סיליקון. Photoresist הוא בדוגמת ואז עם מסכה photolithographic, UV אור, crosslinking SU-8 חשוף. לבסוף, uncrosslinked סו-8 הוא מומס אמבט מפתח. העובש שנוצר משמש להטיל PDMS אשר מודבקת על שקופית מזכוכית כדי לייצר את המכשיר microfluidic מלאה. (B) עבור התקן שכבה כפולה, הזיוף באופן דומה מתחיל בצעדים ציפוי וחשיפה ספין. שלבים אלה חוזרים לאחר מכן ליצור התקן דו שכבתי. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> איור 2: סקירה של זרימת העבודה SiC-seq. המתלה מיקרוביאלית (א) A הוא מעורקיה משותפת עם agarose מותכת במכשיר dropmaker כדי לכמס תאים בודדים ב- microgels. (B) microgels נחשפים לסדרת שוטף לטהר את ה-DNA גנומי חיידקי. Lytic אנזימים מעכלים את קירות התא של חיידקים גראם חיוביים, שמרים, אבקת solubilizes ההריסות הסלולר. Microgels הם מחדש שעברו אנקפסולציה לתוך טיפות עבור tagmentation להקטין זיהום צולב. (ג) המיזוג microfluidic משלב ברקוד PCR דיגיטלי הגנום microgel tagmented, שילוב הגברה בקצב > קילוהרץ. את שבב דליה כליף-PCR splices ברקוד תא בודד ייחודי על גבי הגנום tagmented והגדלה באופן סלקטיבי לחלוטין בונה לבר-קוד. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> איור 3: Microfluidic התקנים לצורך כימוס מחדש dropmaking ו- microgel. (א) לוח זה מראה dropmaker זרימה ושיתוף (25 מיקרומטר של תכונה גובה). מותכת agarose והתאים הם הציגו לתוך המכשיר במחירים שווים זרימה כדי לייצר 25 טיפות מיקרומטר בצומת מיקרומטר מיקרומטר x 25 25. עבור ברקוד דיגיטלי dropmaking, מפרצון תא מחובר לחשמל ולאחר שילוב PCR מוחדרים לים agarose. (B) לוח זה מציג מכשיר כימוס מחדש microgel (25 מיקרומטר של תכונה גובה). Microgels לזרום לתוך מפרץ צר בצורת משפך לשמור על הזמנת לזינוק שלהם ולקבל נפח של tagmentation לערבב לפני העטיפה מחדש-צומת מיקרומטר מיקרומטר 25 x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> איור 4 : Micrographs של טיפות, microgels. (א) לוח זה מראה שטף microgels מיקרומטר 25 לפני פירוק אנזימטי. החיידק fluorescently מוכתמים על כימות של קצב עיטוף. פואסון טעינת נתונים סטטיסטיים להכתיב כי התאים להיות שעברו אנקפסולציה בקצב של 1 ב 10 טיפות או פחות כדי למזער את התדירות של אירועים מרובים-כימוס. (B) לוח זה מציג תמונת מיקרוסקופ זריחה של 25 טיפות ברקוד דיגיטלי של מיקרומטר, מטופלים עם כתם חומצת גרעין. טיפות המכיל קטעים ברקוד מוגבר לייצר אות חזק זריחה. (ג) לוח זה מראה microgels מחדש במארז 50 טיפות מיקרומטר. סגור-האריזה של microgels מאפשר כימוס המחירים מתקרבת ג'ל 1 לכל טיפה עם כמה doublets. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> איור 5 : Microfluidic התקן המיזוג כפול עבור barcoding הגנום בתא יחיד. מבצע מיזוג של שני שלבים זוגות ברקוד טיפות עם הגנום tagmented ב תפוקה גבוהה. Droplet של PCR מיקס ראשון שנוצר, התמזגה עם טיפונת ברקוד באזור שמוצג צהוב באמצעות אלקטרודות מים מלוחים. בשלב הבא, droplet המכיל microgel הציג, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. שמן אינלטס מאפשרים שליטה מדויקת של המרווח בין טיפות reinjected. תא reinjection ברקוד ושמן מרווח שלה ממוקמים על השכבה מיקרומטר 25 קצר יותר, מוצללים בכחול. כל שאר התכונות המכשיר שייך לשכבה עבה יותר עם 45 מיקרומטר של גובה מוחלט. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> איור 6 : ברקוד המדדים קבוצה עבור קהילה מיקרוביאלי סינטטי 10-תא. (א) לוח זה מציג ההתפלגות של הברקוד גודל הקבוצות. מספר קבוצות של גודל נתון יורדת אקספוננציאלית כמו עליות גודל הקבוצה. הסף המינימלי של 7.5 קילו לכל קבוצה מגביל את הניתוח לקבוצות עם כמות מספקת של מידע ומסיר את רצף ה-PCR-מוטציה "יתומים". (B) לוח זה מציג ההתפלגות של ברקוד קבוצה purities. הרוב המכריע (> 90%) של הקבוצות הן של טוהר גבוהה מאוד (> 95%). (ג) לוח זה מציג שפע יחסי של 10 מינים החישוב ברמת הקבוצה קריאה ו ברקוד. 2 שיטות ספירה לייצר תוצאות דומות, המציין כי גודל קבוצה ברקוד יהיו עקביים ברחבי מינים. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> איור 7 : צבירה גנומית סיקור Bacillus subtilis קבוצות ברקוד. קורא כל הקבוצות ברקוד מיפוי החיידק B. subtilis (N = 9,398) הם איחדו וניתח במצטבר. מפת כיסוי מעגלית מדגים אחידות כיסוי הקריאות SiC-seq, עם אזורים לא נושרת מבית הנצפה. קו מקווקו סביב המעגל מציין את הכיסוי הממוצע (5.55 x). ההיסטוגרמה שיבוץ של התדרים כיסוי יחסית מציגה בכמויות גדולות של הבסיסים מכוסים בעומק בקרבת הממוצע הגנום כולו, המיוצג על-ידי הקו המקווקו. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>התקן</td>
			<td>גובה השכבה הראשונה (מיקרומטר)</td>
			<td>הראשונה שכבת ספין מהירות (rpm)</td>
			<td>בשכבה 2nd גובה (מיקרומטר)</td>
			<td>2 שכבת ספין מהירות (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שיתוף זרימה dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג'ל encapsulator מחדש</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>המיזוג כפול</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פרמטרי ייצור ההתקן Microfluidic. טבלה זו מציגה רשימה של התקנים microfluidic שנמצאים בשימוש בזרימת העבודה SiC-seq שלהם במהירויות הנדרש לסיבוב photoresist ציפוי (מבוסס על מפרטי היצרן עבור 3025 SU-8).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תווית</td>
			<td colspan="5">רצף (5' > 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>בר</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פריימר רצף.
משלימה קובץ 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף > הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...