Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
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यहां उपयोग की जाने वाली आनुवंशिक सामग्री को कार्यालय द्वारा बच्चों के लिए HREC (मानव अनुसंधान आचार समिति) (CDF/07/492), मानव सेवा विभाग HREC (10/07) और रॉयल चिल्ड्रन अस्पताल (RCH) HREC (२७०४७) के उपयोग के लिए नैतिक रूप से अनुमोद...

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यहां हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स genotyping की विधि का प्रदर्शन करते हैं । प्रतिनिधि परिणाम मालदी के साथ युग्मित पीसीआर का उपयोग कर उत्पंन किया गया-तोफ सामग्री की तालिक...

मानव जटिल रोग में, आनुवंशिक वेरिएंट रोग संवेदनशीलता के लिए योगदान और इन वेरिएंट रोगजनन समझने के लिए उपयोगी हो सकता है, उच्च जोखिम रोगी समूहों की पहचान, और उपचार प्रतिक्रियाएँ. दरअसल, परिशुद्धता दवा का वादा रोगी उपसमूह1की पहचान करने के लिए जीनोमिक जानकारी का उपयोग करने पर निर्भर है । दुर्भाग्य से, जटिल रोग जीवविज्ञान अंतरिक्ष के भीतर, जहां रोग phenotypes पर्याप्त आनुवंशिक विविधता, कम penetrance, और चर expressivity द्वारा टिकी हैं, के जीनोम के लिए आकार आवश्यकताओं-व्यापक दृष्टिकोण उपंयास की पहचान करने के लिए प्रत्याशी अक्सर बड़े2नकारात्मक स्तर तक हैं । वैकल्पिक रूप से, एक लक्षित उंमीदवार जीन दृष्टिकोण विशिष्ट जीन के बारे में एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के साथ शुरू होता है/ मार्ग विश्लेषण उपकरण सामांयतः एक पहचान लक्ष्य loci के pathophysiology की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, कई उंमीदवार रास्ते पैदा करने के लिए पता लगाया जाएगा । हम यहां एक मल्टीप्लेक्स genotyping एक परख के साथ SNPs के सैकड़ों के लिए दसियों की जांच के लिए अनुमति दृष्टिकोण, मानव पलटन4अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण के माध्यम से अपेक्षाकृत उच्च रखा है, डीएनए नमूनों के हजारों के लिए सैकड़ों की अनुमति उपंयास खोज अध्ययन और विशिष्ट रास्ते की जांच के लिए genotyped हो । यहां उल्लिखित विधियों में एक अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती तरीके से नैदानिक लक्षण के साथ जोखिम alleles और उनके संघों की पहचान करने के लिए उपयोगी होते हैं । इस मंच को स्क्रीनिंग और नैदानिक प्रयोजनों के लिए किया गया है अत्यधिक लाभप्रद5,6, और अधिक हाल ही में, माइक्रोबियल संक्रमण के लिए7 और मानव papillomavirus8।
इस प्रोटोकॉल जांच के लिए जीन का एक सेट के चयन के साथ शुरू होता है, अर्थात्, लक्षित क्षेत्रों, आमतौर पर खोज साहित्य, या रोग की प्रक्रिया में शामिल होने के लिए एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के माध्यम से निर्धारित; या शायद एक डिस्कवरी जीनोम चौड़ा एसोसिएशन (GWA) के अध्ययन के अग्रणी संघों के रूप में प्रतिकृति के लिए चुना है । जीन सेट से शोधकर्ता टैग SNPs की एक परिष्कृत सूची का चयन करेंगे । अर्थात, लिंकेज संतुलन (LD), या सहसंबंध, क्षेत्र में भिन्न प्रकार के बीच में एक प्रतिनिधि ' टैग SNP ' SNPs के एक समूह के लिए उच्च LD, एक haplotype के रूप में जाना जाता है की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस क्षेत्र के उच्च LD का मतलब है कि SNPs अक्सर एक साथ इस तरह विरासत में मिला है कि genotyping एक SNP सभी SNPs में haplotype में भिंनता का प्रतिनिधित्व करने के लिए पर्याप्त है । वैकल्पिक रूप से, यदि कई क्षेत्रों से SNPs की एक निश्चित सूची पर निंनलिखित, उदाहरणके लिए, एक GWA अध्ययन के लिए प्रतिकृति, इस प्रक्रिया को अनावश्यक हो सकता है । के लिए मल्टीप्लेक्स genotyping, एक परख तो इन लक्ष्यों के आसपास डिजाइन किया जाना चाहिए ऐसी है कि प्रवर्धन प्राइमर विस्तार प्राइमरों और उत्पादों के लिए व्याख्यात्मक मास स्पेक्ट्रा उत्पादन के उन लोगों के लिए जन भिंन के हैं । इन मापदंडों को आसानी से एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख डिजाइन उपकरण द्वारा कार्यांवित कर रहे हैं । इस डिजाइन से आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए ब्याज के मार्कर लक्ष्य और SNP युक्त अनुक्रम बढ़ाना इस्तेमाल किया जाएगा । विस्तार प्राइमरों सीधे SNPs और एक एकल, जन संशोधित, ' टर्मिनेटर ' आधार है कि SNP के पूरक है संलग्न जोड़ दिया जाता है । टर्मिनेटर बेस डीएनए के आगे विस्तार को रोकता है । जन-आधार के संशोधन के एक एकल आधार से भिंन टुकड़ों में सक्षम बनाता है जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाएगा । genotyping रसायन युक्त थाली तो एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच पर माप के लिए एक चिप के लिए लागू किया जाता है । कच्चे genotyping कॉल प्रणाली द्वारा पता चला उचित गुणवत्ता नियंत्रण लागू करने के बाद, डेटा और निर्यात किया जा सकता है सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल के लिए रोग phenotypes के साथ सहयोग के लिए परीक्षण ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

जटिल रोगों अक्सर कई आम आनुवंशिक वेरिएंट है कि रोग संवेदनशीलता में योगदान द्वारा टिकी हैं । यहां, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख का उपयोग कर एक लागत प्रभावी टैग एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP) दृष्टिकोण का वर्णन, नैदानिक साथियों में जीन मार्ग संघों की जांच करने के लिए । हम एक उदाहरण के रूप में खाद्य एलर्जी उंमीदवार लोकस Interleukin13 (IL13) की जांच । यह विधि एक क्षेत्र के भीतर साझा संपर्क संतुलन (LD) का लाभ लेने के द्वारा कवरेज को कुशलतापूर्वक अधिकतम कर लेती है । चयनित LD SNPs तो एक मल्टीप्लेक्सित परख में डिजाइन किए हैं, ४० अलग SNPs को सक्षम करने के लिए एक साथ विश्लेषण किया जाएगा, लागत प्रभावशीलता बढ़ाने । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) लक्ष्य loci बढ़ाना, एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार के बाद किया जाता है, और amplicons तो मैट्रिक्स का उपयोग कर मापा जाता है-असिस्टेड लेजर desorption/ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री । कच्चे उत्पादन जीनोटाइप कॉलिंग सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया है, कड़े गुणवत्ता नियंत्रण परिभाषा और कट-नापसंद का उपयोग कर, और उच्च संभाव्यता पादी निर्धारित कर रहे है और डेटा विश्लेषण के लिए उत्पादन ।

प्रोटोकॉल के साथ ऊपर वर्णित है, हम genotyped टैग Th2 प्रतिरक्षा जीन IL13 भर में खाद्य एलर्जी मामलों के एक पलटन में SNPs और9नियंत्रण । हम रसद प्रतिगमन विश्लेषण लागू, पैतृक और अन्य संभावित covariates ?...

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Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण

जटिल मानव रोग के लिए योगदान आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान हमें उपंयास तंत्र की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । यहां, हम उंमीदवार जीन या जीन मार्ग विश्लेषण के लिए एक मल्टीप्लेक्स genotyping दृष्टिकोण है कि कम कीमत पर कवरेज अधिकतम और पलटने के लिए उत्तरदाई है आधारित अध्ययन का प्रदर्शन ।

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

This method can help answer key questions in the clinical diagnostics and genetics fields, such as detecting genetic markers associated with disease outcomes, included the human papilloma virus. The main advantage to this technique is that it's a cost effective targeted and time efficient diagnostic method. To begin this procedure, reconstitute any ordered lyophilized primers with molecular-grade water.Pull the forward and reverse primers for each multiplexed assay into a stock primer mix, such that it contains each primer at a concentration of zero-point-five millimolar. After this, prepare a master mix for the PCR as outlined in the text protocol. Add four microliters of this mix to each well of a 384-well PCR plate, along with one microliter of genomic DNA at a concentration between five and 10 nanograms per microliter.Cover the plate with a plate cover, and centrifuge for 200 times G for one minute at room temperature. Then run the PCR as outlined in the text protocol. Load one microliter of PCR product with three microliters of loading buffer on a 2%agarose gel.Run at 100 volts for 45 minutes to ensure that the DNA amplification was successful. Next, prepare an SAP master mix as outlined in the text protocol. Add two microliters of the freshly made SAP master mix to each well of the previously run PCR plate.Centrifuge briefly at 1, 000 times G for one minute. And then return the plate to the thermocycler. Run the thermocycler at 37-degrees Celsius for 40 minutes.And then at 85-degrees Celsius for five minutes to inactivate the enzyme. After calculating the dilution factor for each primer, combine the determined volumes of each to make up a primer pool. Add water as necessary to dilute this pool.Assemble the extension master mix for either the high plex assay or the low plex assay, as outlined in the text protocol. Add two microliters of the extension master mix to each well of the plate, bringing the total volume in each well up to nine microliters. Centrifuge briefly at 1, 000 times G for one minute, and then return the plate to the thermocycler.After this, add 16 microliters of deionized water to each well, bringing the total volume up to 25 microliters per well. Apply six milligrams of resin evenly across an entire dimple resin plate. Let the resin dry for 20 minutes at room temperature.Then, apply the resin to the reaction plate. Using a suspension mixer, rotate the plate at a slow speed for five minutes at room temperature. Next, centrifuge the plate at 3, 200 times G for five minutes to avoid applying the resin to the mass spectra chip.Upload the plate's sample layout to the system's software interface. Using a dispensing system, apply the genotyping analyte mixture from the plate to the genotyping chip. Load the chip into the MALDI-TOF system to generate the mass spectra from the analyte mixture, and interpret it using the platform's software interface.In this study, multiplex genotyping is accomplished using mass spectrometry. Representative SNP data is generated and analyzed for the candidate gene IL13 in a discovery clinical cohort phenotyped for food allergy. One variant, rs1295686, is associated with challenge-proven food allergy.This is association is confirmed in a replication cohort using the multiplex genotyping approach demonstrated in this protocol. A meta-analysis of the results from the two cohorts provides strong evidence of the association between IL13 with FA.While attempting this procedure, it's important not to contaminate any samples or reagents. It's also important to prepare an extra 10%master mix for each PCR in order to account for any pipetting error.Following this procedure, other methods like real-time PCR can be performed in order to answer additional questions such as whether gene expression correlates with the identified disease-associated genetic markers. After it's development, this technique paved the way for researchers in the fields of clinical diagnostics and genetics to explore disease associations in patient cohorts. Don't forget that when working with genotyping reagents and the MALDI-TOF system can be hazardous, and precautions such as wearing gloves and a lab coat should always be taken when performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

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के Subtyping<em&gt; कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी</em&gt; एसएसपी।<em&gt; doylei</em&gt; का प्रयोग वियोजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विषाक्त पुफेरफिश की बेहतर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में miRNAs परिसंचारी की perturbations एक मल्टिप्लेक्स उच्च throughput जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म का उपयोग कर पाया

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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पालन ​​और मिटायें बीटल में डबल असहाय शाही सेना की मध्यस्थता जीन पछाड़ना,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

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जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

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Thromboxane A2 रिसेप्टर जीन के C924T Polymorphism अध्ययन करने के लिए एक विधि

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

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एक तेजी से और मात्रात्मक विधि के बाद अनुवाद संशोधन और संस्करण के लिए पेप्टाइड्स की मैपिंग जीनोम के लिए सक्षम

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...