Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
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这项研究得到了由科学、信息和通信技术和未来规划部 (NRF-2017M3D1A1039421) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 和由由该国资助的海洋生物技术项目提供的创造性材料发现方案的支持。大韩民国海洋和渔业部和赠款 (20150220)。

所有实验程序, 包括动物处理, 牺牲和器官隔离都严格按照国际动物保育和使用委员会的规则, 在上海公共卫生临床中心和峨山医疗中心。《研究议定书》获得了上海市公共卫生临床中心 (小鼠协议号: SYXK-2010-0098) 和峨山医疗中心 (2016-02-168) 的动物实验伦理学委员会的批准。
1. 材料的制备
注: 一种纳米佐剂, 由自组装的脂质 DNA 载体组成, 即 U4T 和含有寡核苷?...

<ol>
	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response.">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li><li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+soft+matter+lipid-DNA+nanoparticle+as+the+immunostimulant+via+multiple+routes+of+injection+in+vivo.">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science &amp; Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li><li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. 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Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

通过药物传递和免疫刺激的治疗研究, 纳米技术和免疫学取得了许多进展。仔细选择注射方法对免疫刺激是很重要的, 这是目前研究的重点。
对一种天然无毒和可生物降解的基于 DNA 的材料 (免疫刺激性纳米粒子) 进行了不同的注射路线评估, 以确定哪条路线取得了最佳结果。这种方法也适用于提供其他治疗药物, 包括抗体, 抗原, 或其他佐剂。
为了分析这种...

免疫学和纳米材料的进步导致了大量的潜在的新的治疗策略应用于生物医学, 包括药物的传递和免疫刺激。优化管理路径是影响免疫刺激性剂疗效的重要方面。由 dna 组成的免疫刺激性纳米粒子 (相) 是一种新研制的纳米免疫佐剂, 自组装而成, 其两亲性结构为脂 dna1。因此, 涉及在体内通过不同途径管理物质1的方案, 以及三种采集适当组织的程序, 如腹股沟淋巴结 (iLN)、纵隔 LN (mLN) 和脾脏, 都是描述。最后, 对这些组织进行了树突状细胞 (DC) 活化、免疫系统中功能最强的抗原呈现细胞的分析。该协议也可用于评估抗原, 抗体, 或其他免疫佐剂2。 
我们测试了它的配方, 因为它是一个显示了巨大的承诺的代理。核核是一种类似于收费的受体 9 (TLR9) 佐剂材料, 含有核酸, 对免疫刺激疗效的评估需要测试不同的注射方法3。在这种情况下, 对 DCs 的刺激是体内评价的一个有效端点。在抗原或免疫刺激性分子由 DCs 吞噬的外围组织或血液, 这些细胞迁移到淋巴器官, 如脾脏和 LNs4,5。因此, 对注射动物的脾脏、iLN 和 mLN 进行了 DC 活化分析。因此, 适当地收割这些组织对评估免疫应答的新的佐剂或病原体也是至关重要的5。这种组织收获对于开发一种新的免疫方法作为癌症治疗也很重要。此外, 该议定书可用于验证其他药物的效率, 如抗人体免疫机能丧失病毒疗法6。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

为评估一种新的免疫治疗药物或疫苗接种, 分析淋巴组织中的免疫细胞活化是必不可少的。在这里, 我们研究了一种新的脂质 DNA immunostimulant 在纳米粒形态中的免疫效应, 从小鼠的不同管理途径: 口服, 鼻腔, 皮下, 都安, 腹腔和静脉。这些注射将直接影响免疫反应, 收获淋巴组织和分析的树突状细胞 (DC) 激活的组织是这些评价的关键部分。纵隔淋巴结的提取 (mLNs) 是重要的, 但由于该器官的大小和位置而相当复杂。本文介绍了用流式细胞仪采集腹股沟淋巴结 (iLN)、mLN 和脾脏的逐步过程, 并分析了直流活化的方法。

为评价 CD11c 在淋巴组织 dc 活化中的合适注射途径, 将 dc 种群作为谱系定义为-脾 、iLN、mLN 中的多细胞, 并分析了共刺激分子的表达水平。经皮下 (南卡罗来纳州) 和静脉注射 (静脉注射) 注射治疗, 促进了脾脏和 iLN DCs 中 CD40、CD80 和 CD86 表达的大幅增加 (图 2B和2C)。与 PBS 治疗的控制相比, 都安和腹腔 (ip...

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Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

免疫刺激性剂评价: 淋巴组织提取与注射路径依赖性树突状细胞活化

在 immunostimulating 纳米材料治疗后, 对淋巴组织进行后续提取实验, 以检测淋巴树突状细胞活化。

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

此过程的总体目标是熟悉将细胞性淋巴结与小鼠隔离所需的独特技术。手术是在小鼠的六条不同途径上注射免疫刺激物质后进行的。在这项研究中，我们使用了形成纳米结构的新材料。表面活性剂由亲水性头组和疏水性尾部组成。那些形成球形米特尔或其他二级结构由于微噬细胞分离。我们利用这个属性，一个生物大分子，是DNA。此处所示的DNA两栖动物作为常规核苷酸（如 A、C、G、T）具有亲水性块，而脂质改性神经细胞核碱则充当疏水单位。经过改良的寡头由DNA合成器在大规模八位图中合成。在等介质中，两栖脂质DNA自发地形成纳米大小的球形球状当米特尔形成时，DNA仍为直径约10纳米的空载体。为了使载体具有免疫刺激，用收费样受体9辅助物eCpG来扩展DNA序列是很简单的。脂质DNA和eCpG基座在这里，因此米特尔的外表面退化与CpG序列。然后，我们将这种免疫刺激纳米粒子称为 INP。为了确定 INP 的免疫反应的正确方法，我们在 64 条注射路线中向小鼠注射 INP，从而分析了适当的淋巴结组织。有关更详细的注射说明，请找到查尔斯·里弗在2012年发表的一篇工作文章。此视频的主要优点是直观地展示如何获得媒体淋巴结。该视频明确显示了中心淋巴结的位置，很多人发现在隔离器官方面有困难。所有实验都是在上海公共卫生临床中心（Ulsan医学院）机构动物护理和使用委员会的指引下进行的。本部分将显示器官或组织的具体位置，这对免疫学分析至关重要。脾脏和两个淋巴结将被隔离。首先，老鼠因吸入二氧化碳安乐死而牺牲，并按照机构动物护理和使用委员会的指导，作出一切努力，尽量减少痛苦。从现在开始，让我们找到器官并隔离它们。首先，将鼠标正确固定到操作台上，在鼠标手掌上固定四个针脚。用酒精消毒解剖区。用大尺寸剪刀解剖小鼠腹部底部的外盖。使用钳子打开附件的两侧，并在操作台上用销固定附件。通过发现向左腿向下移动的血管的连合，暴露了内淋巴结的位置。容器的形状看起来像倾斜的字母字母Y. 揭开层与钳子，并把它从皮肤。用较小的剪刀切割内膜，以暴露内脏。使用钳子将肠子向左移动，然后包裹在形状的脾脏中，脾脏在腹部左侧、左上侧显示。在手术过程中需要特别注意，因为脾脏很容易被破坏。最后这个视频的要点：收获中淋巴结。它位于肺的上部下，这是很难看到的，由于其小尺寸和有点隐藏的位置。用小剪刀和钳子小心地露出区域。切肋骨和隔膜的两侧。将切断的肋骨夹在胸前。在手术过程中，避免损害心脏和血管，因为它可能会使部位失明，找到半透明的中心淋巴结。如果意外血管破裂，用纱布轻轻擦去血迹。抓住肺的左侧，轻轻地把它翻到另一边，看看肺下面。用钳子拉起中序淋巴结。收获中序淋巴结后，确保完全去除淋巴结周围的所有脂肪和血液，因为不需要的组织可能会影响分析。最后，所有孤立的器官在装满介质的培养皿上。在此流式细胞学上分析共0.1倍10至第六细胞。基于力的获取和大小，白细胞种群被封闭，细胞被暗染色排除。INP注射后24小时，通过64个注射途径，脾脏，内结淋巴结和内序淋巴结被收获，并分析直流活化通过流细胞学。基于流细胞学DC组的策略，定义为活白细胞中的CD11C阳性和血统性阴性细胞。值得注意的是，与PBS相比，INP的鼻内注射促进了中序淋巴结CD40、80、86表达的显著增加。因此，该数据表明，INP的鼻内注射可以用作增强肺部免疫力的粘膜佐剂。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

科研

免疫与感染

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

小鼠骨髓来源的树突状细胞与跟踪研究的Qdot纳米晶的生成及标签

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

过敏性气道炎症在肺树突状细胞的成熟和迁移分析

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

监测树突状细胞迁移<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁共振成像

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

在体外产生的常见淋巴祖使用AC-6馈线系统的小鼠浆细胞样树突细胞

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

不成熟，成熟和耐受性树突状细胞的生成与代谢不同表型

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

体内人淋巴组织和女性生殖器粘膜与人体免疫机能丧失病毒1和 Histoculture 的感染

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

小鼠骨髓基质树突状细胞诱导 CD4 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化的体外模型研究

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...