Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00
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エレクトロポレーション システムのセットアップのヘルプ、箱陳教授、博士越張とケンディ ホアンに感謝します。この作品は、Z.A.W. にサンタ ・ クルスがん給付グループと NIH からの補助金によって支えられました。

ガイドラインと規制機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学サンタクルスからに従ってここで説明したすべての手順を行った。
1 プラスミドとツールの準備
<ol><li>それぞれの膀胱を使って、DNA のプラスミッド (1 μ g/μ L) の少なくとも 20 μ L を準備します。</li>
	<li>1.5 mL 容マイクロ チューブにおけるプラスミド溶液 20 μ L にトリパン ブルーの 1 μ L を?...

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

エレクトロポレーションは細胞膜透過性を高め、遺伝子電子伝達系16のための強力な技術です。電気穿孔法による生活を齧歯動物への遺伝子導入は神経生物学分野17,18,19,20,21によく使用されています。他の多くの器官の潜在的な応用は広範囲にわたって?...

遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、動物の開発、遺伝子機能生体内、および疾患進行1,2メカニズムに関する知識の拡大に重要な役割を演奏されています。生殖 GEMMs は伝統的に 2 つの方法で開発されています。最初の偽妊娠女性に受精卵移植による続く DNA のプラスミッドの前核注入によるトランスジェニック マウスの作成です。他のアウト/ノックアウト ・ ノックイン マウス胚性幹細胞での相同組み換えによる生成とキメラの開発です。興味の特定の組織や細胞の種類の遺伝子のノックアウト条件付きにはには、複数世代の Cre、flox のサイトと遺伝子組み換え遺伝子の繁殖が含まれます。全体のプロセスが高価な目標は、組織に複数の遺伝子を対象とする場合は特に、時間のかかることができます。最近では、クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの遺伝子編集技術はモデリング3、土着の癌組織特異遺伝子変異を誘導するマウスの複数の器官に適用されています。 4,5,6,7または8,9その場で正しい病気の突然変異。これらの研究では、gRNA ベクトル配信通常器官または流体の尾静脈注射のアデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染によって達成されました。利便性と癌の伝統的な Cre Lox 基づくマウス モデルと比較してこれらの器官のモデリングの効率、肺と肝臓への CRISPR コンポーネントの配信の相対的な容易さが大幅に向上します。
膀胱尿路上皮はほとんど膀胱腫瘍が発生します。膀胱尿路上皮癌モデリングや遺伝子治療への DNA ベクターの配信は、ウイルス感染の10、11の付着のための障壁として機能する頂尿路上皮表面にグリコサミノグリカン層によって妨げられています。Syn3 などドデシル-β-d-maltoside いくつかの前処理剤は、この障壁を破壊し、アデノ ウイルス感染効率12,13,14を高めるために使用されています。アデノ随伴ウイルス (通気) することができます効果的に膀胱に感染するかどうかは報告されていません。全体的にみて、非ウイルス性に基づいて配信方法が望ましいでしょう。ここでは、尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによるマウス尿路への効率的な DNA プラスミド配信のラボで開発手法について述べる.我々 のアプローチは、グリコサミノグリカン レイヤーまたはウイルス産生の化学的前処理を含まない、それ自体が大幅 DNA プラスミドのマウス膀胱尿路への導入を簡略化し、様々 な体内調査を促進する必要があります。膀胱疾患。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD 1mL TB Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>148232E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9275-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-21</td>
			<td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Vet one</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K&#38;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cover the heat mat with paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0849514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &#181;L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02707438(CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P200N</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid CAG-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum tweezertrode 5 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450489</td>
			<td>5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>String cord</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, Scotch</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19047257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td>
			<td>PBS animal health</td>
			<td>353-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-1 Table top system anesthesia</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl violet suture 18&#34; FS-2 cutting 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0578475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td>
			<td>Walgreens</td>
			<td>953982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>018045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01804</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、癌などの人間の病気の開始そして進行のメカニズムを生物学的知見を明らかに非常に貴重です。遺伝子発現形質転換および条件付きノックアウト マウスが頻繁に使用されているまたは特定のティッシュかセルでアブレーション タイプの生体。ただし、生殖マウス モデルの生成は、時間がかかり、高価にすることができます。遺伝子編集技術及びウイルス感染によってプラスミド DNA を提供することの実現可能性の最近の進歩は、いくつかの臓器の非生殖土着マウス癌モデルの急速な生成を有効にしています。膀胱は、ウイルスベクター尿路を覆うグリコサミノグリカン層の存在のために、アクセスするは難しいされている器官です。ここでは、マウス膀胱尿路上皮の体内に DNA プラスミドの効率的な配信のためのラボで開発された手法について述べる.PCAG GFP プラスミドの膀胱内注入および外科的露出膀胱のエレクトロポレーション、膀胱尿路上皮細胞一過性発現のために具体的には DNA のプラスミッドを配信できることを示す.本手法は過剰発現とマウス膀胱における遺伝子のノックダウンのため迅速かつ便利な方法を提供します、膀胱がんや他の泌尿器科疾患の GEMMs を構築に適用することができます。

膀胱尿路上皮への遺伝子導入の成功を示すためには、エレクトロポレーションに pCAG GFP15プラスミドを使用しました。尿道を通って注入されたプラスミドのトリパン ブルー溶液 20 μ L と 5 の電気パルスを投与します。48 時間後は、マウス膀胱を解剖し、負の制御 (図 1 a) GFP シグナルを示さなかったエレクトロポレーションを受?...

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

マウス膀胱の生体内で尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによる尿路上皮細胞への DNA のプラスミッドの配信手法について述べる.膀胱疾患の土着のマウス ・ モデルを生成するための迅速かつ便利な方法を提供しています。

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...