Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00
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Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.
1. plasmídeo e preparação de ferramentas
<ol><li>Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).</li>
	<li>Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta pa...

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. ...

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.
O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD 1mL TB Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>148232E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9275-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-21</td>
			<td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Vet one</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K&#38;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cover the heat mat with paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0849514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &#181;L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02707438(CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P200N</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid CAG-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum tweezertrode 5 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450489</td>
			<td>5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>String cord</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, Scotch</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19047257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td>
			<td>PBS animal health</td>
			<td>353-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-1 Table top system anesthesia</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl violet suture 18&#34; FS-2 cutting 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0578475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td>
			<td>Walgreens</td>
			<td>953982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>018045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01804</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electro...

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Biology

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In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

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Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

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A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

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Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

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