Name: light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells at JoVE.com

אנו מודים המכון Hemostaseology קלינית ורפואה עירוי למתן דם התורם; כרמן Hässig, קורה Hoxha לעזרה טכנית מצוינת. אנו מודים רטיג ג'נס (אוניברסיטת חבל הסאר) עבור וקטור pMAX ששונה רולנד Wedlich-Söldner (אוניברסיטת מינסטר) עבור הבונה LifeAct-רובי המקורי, כריסטיאן יונקר (אוניברסיטת חבל הסאר) ליצירת הבונה LifeAct-mEGFP. הפרויקט מומן על ידי 1027 Sonderforschungsbereich (פרוייקט A2 כדי B.Q.) ו- 894 (פרוייקט A1 מ. ה). מיקרוסקופ אור גיליונות מומן על ידי DFG (GZ: מוסד 256/4 19-1 FUGG).

מחקר המבוצע במחקר זה החומר האנושי (ליקוציט צמצום מערכת צ'יימברס מתורמים דם אנושי) מוסמך על ידי ועדת האתיקה המקומית (ההכרזה מ- 16.4.2015 (84/15; פרופסור ד ר רטיג-Stürmer)), עוקב אחר ההנחיות המתאימות.
1. הכנת קולגן ינוטרלו פתרון (500 µL)
<ol><li>העברת µL 400 של קולגן צוננת מניות פתרון (10.4 mg/mL) צינור mL...

<ol>
	<li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensions+in+cell+migration.">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li><li>Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+migration,+search+strategies+and+mechanisms.">T cell migration, search strategies and mechanisms.</a> Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+cell+survival+factor.">The extracellular matrix as a cell survival factor.</a> Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development.">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).</li><li>Schoppmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+profilin+1+is+a+negative+regulator+of+CTL+mediated+cell-killing+and+migration.">Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration.</a> Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+cells+enhance+NK+cytotoxic+efficiency+by+reducing+search+time.">Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time.</a> Sci Rep. 7, 44357 (2017).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration.">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer).">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro.">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy.">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li></ol>

רוב מבחני במבחנה מתבצעות על משטח דו-מימדית, לדוגמה-פטרי, לוחיות תרבית תאים או על coverslips, ואילו ויוו תאים, במיוחד תאים חיסוניים, לחוות בעיקר microenvironment תלת-ממד. מתעוררים ראיות מראה כי דפוסי ההגירה של תאים חיסוניים שונים בין תרחישים של 2D and 3D-17. יתר על כן, ביטוי פרופילים של ת?...

רוב הידע אודות מעבר תאים נובע 2D ניסויים1,2,3, אשר נערכים בדרך כלל בכוס, או משטח הפלסטיק של תרבות/הדמיה המנה. עם זאת, תרחיש פיזיולוגיים דורש, ברוב המקרים, microenvironment תלת-ממד, שבו מטריצות (ECM) ממלא תפקיד מכריע. ECM לא רק מספק הארומטיים במבנה התלת-ממדי כדי לשמור על מורפולוגיה התא הנכון אלא מציע גם אותות הישרדות או הכיוון הנכון לתפקוד אופטימלי של תאים רבים4,5 . לכן, נדרשת סביבה תלת-ממד לזיהוי טוב יותר של פונקציות תאית והתנהגות בסביבה כדאי המשקף את ההקשר פיזיולוגיים.
בגוף האדם, רוב התאים במיוחד תאים חיסוניים, להפעיל את הפונקציות שלהם תחת תרחיש תלת-ממד. לדוגמה, בתאי T מופעל סיור רקמות בחיפוש אחר התאים היעד, תמים T תאים נודדים דרך הלימפה בחיפוש אחר תאיהם אנטיגן cognate שבמהלכה מצב ההעברה, מכונות מותאמים המתאימה חוץ-תאית הסביבה3,6,7. הג'ל קולגן 3D כבר בשימוש נרחב כמו תא 3D ומבוססת, מאופיין היטב בתרבות מערכת8,9,10. העבודות הקודמות שלנו מראים כי ראשי לימפוציטים אנושיים הם ניידים מאוד להעביר במהירות ממוצעת של מיקרומטר סביב 4.8/min מבוססי קולגן מטריצה 0.25%11. סידורם מחדש של שלד התא ממלא תפקיד מפתח ההעברה תא12. לצבירת ראיות מראה כי לימפוציטים אינן חלות רק מצב אחד של הגירה עדיין יכול לעבור בין התנהגות מסוימת ההעברה בהתאם למיקום, microenvironment, ציטוקינים, מעברי צבע chemotactic, חוץ-תאית אותות איזה מנגינה התנהגות נודדים בדרכים שונות 3.
לנתח באופן אמין תא החיסון פונקציות והתנהגות, לדוגמה, הגירה, תיתכן היווצרות או תחבורה vesicular, זה יתרון גדול כדי שניתן יהיה לרכוש תמונות בכמויות גדולות יחסית 3D בצורה מהירה ואמינה. הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) מציע פתרון משביע רצון13,14. במהלך הדימות רכישה, סדין דק אור הסטטי נוצר כדי להאיר את הדגימה. בדרך זו, על מישור המוקד, שטח גדול יכול להיות מואר בו-זמנית מבלי להשפיע על התאים את המטוס. תכונה זו מאפשרת מהירות גבוהה רכישה מופחת באופן דרסטי הלבנה, photocytotoxicity. בנייר זה, אנו מתארים איך לדמיין ראשי תאים חיסוניים האנושי באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות ואיך לנתח את ההעברה בתרחיש של תלת-ממד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibricol, bovine collagen solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>&#160;#5133-20ML</td>
			<td>Collagen matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M NaOH Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1091381000</td>
			<td>for neutralizing Fibricol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low melting agarose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>32821-10GM</td>
			<td>Sample preparation in low c[Col]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11348D</td>
			<td>Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11132D</td>
			<td>Activation of CTL populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant interleukin-2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC0023</td>
			<td>Stimulation of cultured CTL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary solution kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-30XX</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-PFN1 antibody, rabbit, IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124904</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22284</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Fluorescent cell label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-250mL</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>018774</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Dulbecco&#39;s phopsphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945; Rabbit 568, IgG, rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HeraSafe KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator HERACell 150i&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418 and 5452</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-444, 89079-436, 89079-452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&#160;62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries 50 &#181;L</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>613-3373</td>
			<td>Zeiss LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger for capillaries</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>BRND701934</td>
			<td>&#34;Stamps with Teflon tip&#34; LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MColorPhast pH stips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1095430001</td>
			<td>to test pH of neutralized Fibricol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z230723&#160;ALDRICH</td>
			<td>Alternative sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td>
			<td>Play-Doh</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris file converter</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Convert imaging files to Imaris file format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Analysis of 3D and 4D imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells

In vivo, הפעלה, התפשטות, ותפקודו של תאים חיסוניים כל להתרחש בסביבה תלת מימדי (3D), למשל בבלוטות הלימפה או רקמות. עד כה, רוב במבחנה מערכות להסתמך על משטחים (2D) דו מימדי, כגון לוחות תרבית תאים או coverslips. מחקים בצורה אופטימלית בתנאים פיזיולוגיים במבחנה, אנו מנצלים על מטריצת קולגן 3D פשוטה. קולגן הוא אחד המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) והוא כבר בשימוש נרחב להוות מטריצות תלת-ממד. עבור הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) בהשתתפות עם מהירות גבוהה רכישה, עומק החדירה גדול, הלבנת נמוך ו photocytotoxicity. יתר על כן, מיקרוסקופ אור גיליונות הוא יתרון מיוחד עבור מדידה ארוכת טווח. כאן נתאר פרוטוקול ממוטבת כיצד להגדיר ולטפל תאים חיסוניים אנושי, למשל ראשי האדם ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) ואת הרוצח הטבעיים (NK) תאי מטריצת קולגן תלת-ממד לשימוש עם מיקרוסקופ אור גיליונות עבור הדמיה תא חי, דוגמאות קבועות. ההליך עבור ייבוא תמונות וניתוח של נדידת תאים מוצגים. דגש מיוחד ניתן להדגיש שלבים קריטיים וגורמים עבור הכנת הדוגמא וניתוח נתונים. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים ההשעיה במטריצה קולגן תלת-ממד ואינו מוגבל תאים חיסוניים.

תיתכן היווצרות במהלך ההעברה תא T הוא תהליך דינמי מאוד, אשר תלויים אקטין. כדי להמחיש תיתכן היווצרות CTL אנושי ראשוני, אנחנו transiently transfected חלבון mEGFP התמזגו לתייג את שלד התא אקטין ב- CTL כמתואר לפני11. יום אחד לאחר תרביות תאים, התאים היו מוטבע קולגן המטריצה. אוספי תמונו...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells at JoVE.com

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...