Name: characterization of aquatic biofilms with flow cytometry
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry at JoVE.com

أيد العمل قدمت زمالة أمبيزيوني الجبهة الوطنية الصومالية (PZ00P2_142533) ومنحة بحثية فيلا (أمبليبيج). نود أن نشكر بتينا فاغنر للحصول على تعليمات العمل التجريبي.

1-النظام الإيكولوجي الاختيار وأخذ العينات بيوفيلم
<ol><li>حدد النظام إيكولوجي المائي من الاهتمام والبحث عن مواقع أخذ العينات التي تنمو فيها الأغشية الحيوية. الأجزاء الضحلة من تيار مع بطء تدفق المياه المتوسطة وجف حجرية لمرفق بيوفيلم المناسبة17،18.</li>
	<li>اختيار?...

<ol>
	<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stressors+in+periphyton+-+comparison+of+observed+and+predicted+tolerance+responses+to+high+ionic+loads+and+herbicide+exposure.">Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure.</a> J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollution-induced+community+tolerance+(PICT):+towards+an+ecologically+relevant+risk+assessment+of+chemicals+in+aquatic+systems.">Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems.</a> Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).</li><li>Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mine+of+information:+Benthic+algal+communities+as+biomonitors+of+metal+contamination+from+abandoned+tailings.">A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings.</a> Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).</li><li>Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+chronic+and+acute+pesticide+exposures+on+periphyton+communities.">Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities.</a> Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).</li><li>Dorigo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lotic+biofilm+community+structure+and+pesticide+tolerance+along+a+contamination+gradient+in+a+vineyard+area.">Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area.</a> Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).</li><li>Pesce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+single+and+joint+toxic+effects+of+diuron+and+its+main+metabolites+on+natural+phototrophic+biofilms+using+a+pollution-induced+community+tolerance+(PICT)+approach.">Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach.</a> Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).</li><li>Ricart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+low+concentrations+of+the+phenylurea+herbicide+diuron+on+biofilm+algae+and+bacteria.">Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria.</a> Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).</li><li>Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf-litter+leachate+concentration+promotes+heterotrophy+in+freshwater+biofilms:+Understanding+consequences+of+water+scarcity.">Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity.</a> Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).</li><li>Corcoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+comprehensive+assessment+of+16S+rRNA+bacterial+diversity+in+marine+biofilms+using+high-throughput+sequencing.">Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing.</a> Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).</li><li>Welsh, A. K., McLean, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacteria+in+mixed+biofilm+communities+using+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+(DGGE).">Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).</a> Curr Protoc Microbiol. , (2007).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+Biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability.</a> Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+periphyton+using+liquid+chromatography-organic+carbon+detection-organic+nitrogen+detection+(LC-OCD-OND).">Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND).</a> Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).</li><li>Kroll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+messages+from+benthic+microbial+communities+exposed+to+nanoparticulate+and+ionic+silver:+3D+structure+picks+up+nano-specific+effects,+while+EPS+and+traditional+endpoints+indicate+a+concentration-dependent+impact+of+silver+ions.">Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions.</a> Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).</li><li>Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+combined+with+viSNE+for+the+analysis+of+microbial+biofilms+and+detection+of+microplastics.">Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics.</a> Nat Commun. 7, 11587 (2016).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+the+biofilm+concept+and+types+of+aquatic+biofilms.">Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms.</a> Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).</li><li>Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+disturbance+history+affects+patchiness+of+benthic+river+algae.">Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae.</a> Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).</li><li>Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropollutant-induced+tolerance+of+in+situ+periphyton:+Establishing+causality+in+wastewater-impacted+streams.">Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams.</a> Water Res. 111, 185-194 (2017).</li><li>Robinson, C. T., Rushforth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physical+disturbance+and+canopy+cover+on+attached+diatom+community+structure+in+an+idaho+stream.">Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream.</a> Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).</li><li>Pomati, F., Nizzetto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+triclosan-induced+ecological+and+trans-generational+effects+in+natural+phytoplankton+communities:+A+trait-based+field+method.">Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method.</a> Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).</li><li>Hulliger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgew&#228;sser. , (2007).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+spatio-temporal+changes+in+pollution-induced+community+tolerance+to+zinc+in+autotrophic+and+heterotrophic+biofilm+communities.">In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities.</a> Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).</li><li>Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sonication+on+bacteria+viability+in+wastewater+treatment+plants+evaluated+by+flow+cytometry+-+Fecal+indicators,+wastewater+and+activated+sludge.">Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge.</a> Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).</li><li>Buesing, N., Gessner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+detachment+procedures+for+direct+counts+of+bacteria+associated+with+sediment+particles,+plant+litter+and+epiphytic+biofilms.">Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms.</a> Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+t-SNE+using+Tree-Based+Algorithms.">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li></ol>

بسيطة نسبيا لتنفيذ البروتوكول، المذكورة أعلاه. ومع ذلك، بينما أظهرت الإعدادات الافتراضية المعروضة تكون مناسبة لجميع فوتوتروفيك بيوفيلم اختبارها حتى الآن، الأمثل (كما هو موضح في البروتوكول) اللازمة لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المستقاة من الأسلوب. وفي الواقع، يمكن أن تختلف الخصائص البصر...

الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، بدءاً من الإنتاج الأولى، والمغذيات، وتنقية المياه إلى التأثير على توزيع الكائنات الحية الدقيقة وتنوعها البيولوجي في النظام الإيكولوجي 1-عندما يتعرض الأغشية الحيوية للظروف البيئية المتغيرة أو لعوامل الإجهاد، مثل المواد الكيميائية، على بنية المجتمع بسرعة التحولات نحو أكثر تسامحا الأنواع2،3. يتحول حساسية عالية الأغشية الحيوية إلى نموذج جذاب نظم ل الرصد البيئي4، إلا أن أيا من الأساليب الحالية تعتبر مناسبة تماما لتتبع دينامية مجتمع بيوفيلم فعلا بطريقة سريعة وسهلة.
مجموعة شائعة من أساليب لتوصيف الأغشية الحيوية يتكون القياس من نقاط النهاية الوظيفية والهيكلية. على مستوى المجتمع بأكمله، نشاط التمثيل الضوئي والجهاز التنفسي، فضلا عن نشاط إنزيمات خارج الخلية ويقدم معلومات عن الدولة الوظيفية بيوفيلم5،،من67،8 ،9. الاستحقاق الكتلة الحيوية كمؤشر للنمو بيوفيلم العام. يتم قياس التغيرات الهيكلية حاليا أما باستخدام تعريف الأنواع التقليدية الخفيفة الميكروسكوب أو مع التقنيات المستندة إلى النوكليوتيدات (مثلاً، يشوه جل التدرج التفريد (دج)، فاصل إينتيرجينيك ريبوسومال الآلي تحليل (اريسا)، metagenomics)10،،من1112. هذه الأساليب توفير المعلومات ولكن تستغرق وقتاً طويلاً لإجراء، أو يتطلب معرفة محددة، أو لا تزال قيد التطوير. وأخيراً، أساليب جديدة للتقييم لل13،المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)14 وبيوفيلم العمارة1، بينما يراعي، الإنتاجية منخفضة ولم توضع حتى الآن نحو أغراض الرصد.
فمن الواضح أن لتوصيف كامل للأغشية الحيوية المياه العذبة، من الضروري الجمع بين عدة طرق مختلفة، التي توفر نظرة ثاقبة وظيفة بيوفيلم وتكوينها والهندسة المعمارية. للرصد البيئي، من ناحية أخرى، طريقة سريعة والحساسة التي قادرة على الكشف عن التغييرات في بيوفيلم وتمكين تفسير البيولوجية الأساسية من التحولات على المستوى الوظيفي والهيكلي المطلوب.
لقد قمنا بتطوير أسلوب جديد لتوصيف المجتمع الميكروبي لعنصر فوتوتروفيك تيار الأغشية الحيوية (periphyton)، وهي سريعة بما يكفي لأغراض الرصد، وفي نفس الوقت يقدم معلومات كافية عن المجتمع بيوفيلم هيكل للسماح للتفسير البيولوجي15. أنه استناداً إلى خلية واحدة التدفق الخلوي (FC) من عينات بيوفيلم ويقترن التصور الحسابية ويوفر معلومات عن الخصائص البصرية ونيون بيوفيلم على مستوى الخلية الواحدة.
يتكون سير العمل بعد أخذ العينات بيوفيلم لإعداد نموذج في شكل sonication والتثبيت وعلى أساس حجم تصفية عينات متبوعاً بتقييم العينة بالتدفق الخلوي. البيانات المكتسبة بتقديم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، اللاأحيائية المحتوى (مثل ميكروبلاستيكس) في بيوفيلم. هذه المجموعة من البيانات من تحليلها عن طريق التصور الحسابية الجار العشوائية المرئية التضمين (فيسني)16، الذي يتيح لتفسير البيانات بسرعة وسهولة باستخدام. على الرغم من أن بضعة أسابيع هي المطلوبة لإعداد وتحسين الأسلوب، مرة بإعداد، فإنه يأخذ فقط بضع ساعات من جمع عينات بيوفيلم لتفسير النتائج.
المزايا الرئيسية لأسلوب عرضها على الآخرين هي سرعة التحليل وعالية-معلومات-المحتوى. وعلاوة على ذلك، يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع بعد جمع دون فقدان بهم الضوئية وخصائص الأسفار. يمكن أن يكون هذا مفيداً عندما وصف عدد كبير من العينات المطلوبة، مثل دراسات عينات كبيرة أو برامج الرصد البيولوجي، ولكن يمكن أيضا أن توفر كمية كبيرة من المعلومات في أصغر من الدراسات الاستكشافية.
البروتوكول قدم يستند إلى تحليل تدفق سيتوميتريك فوتوتروفيك الأغشية الحيوية (periphyton) التي تم جمعها من مواقع مختلفة من دفق. العديد من الخطوات للبروتوكول، مثل اختيار مواقع مناسبة لأغراض، الرصد تعتمد على أهداف البحث و ولذلك لا يمكن وصفه. الآخرين السماح أقل حرية، وتتطلب أن البروتوكول هو تابع عن كثب، وهذا هو توضيحها في البروتوكول بالتفصيل أدناه.
البروتوكول يبدأ باختيار مواقع للرصد البيئي على أساس بيوفيلم. والخطوة التالية لإنشاء التدفق--سيتوميتير (FC) حيث أن تمكين قياساته التمييز بين الكائنات فوتوتروفيك مختلفة تعيش في الأغشية الحيوية في رصد البيئة. هذا يتم عن طريق جمع عينات بيوفيلم من المواقع، وتحديد خصائص الأنواع المختلفة الموجودة في بيوفيلم وإعداد التدفق--سيتوميتير مع أشعة الليزر وعوامل التصفية التي تمكن من قياس في المناسبة الضوئية الفلورية الأطوال الموجية. وبمجرد لجنة التيسير وقد تم إنشاء، الأغشية الحيوية يمكن جمعها من المواقع دورياً، خصائص الجسيمات مفردة موجودة في بيوفيلم تقاس بالتدفق الخلوي، وبيانات تحليلها من قبل المجموعات المرئية البصرية ونيون. أفضل تفسير للنتائج، فمن الممكن بناء قاعدة مرجعية FC الأنواع الحية بيوفيلم المحلية وتعمل بها، واستخدام قاعدة البيانات للتعرف على التصنيفات المختلفة في البيانات FC. من الممكن التحقق من الصحة من خلال الأسفار-على أساس فرز المجموعات المحددة للخلايا المفردة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحديد التقسيمي القائم على الفحص المجهري للأنواع الحالية. ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1095">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Multimeter</td>
			<td style="width:123px;">WTW</td>
			<td style="width:344px;">MultiLine 3620 IDS</td>
			<td style="width:413px;">For measuring temperature, pH, dissolved oxygen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97043-986</td>
			<td>Tank dimesions: 15*14*10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td style="width:413px;">Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td>used for selecting appropriate setting of the FC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:123px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:344px;">MoFlo Astrios</td>
			<td style="width:413px;">Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 135</td>
			<td style="width:413px;">Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2013a</td>
			<td>software for numerical computing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CYT</td>
			<td>Dana Pe&#39;er Lab</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>free interactive visualization tool for analysis of cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of aquatic biofilms with flow cytometry

الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة. عن طريق تغيير بنية المجتمع بهم، الاستجابة بسرعة للتغيرات البيئية الأغشية الحيوية ويمكن استخدامها كمؤشرات لنوعية المياه وهكذا. في الوقت الراهن، يستند تقييم بيوفيلم معظمهم نهايات التكاملي والوظيفي، مثل نشاط التمثيل الضوئي أو الجهاز التنفسي، التي لا تقدم معلومات عن هيكل المجتمع بيوفيلم. التدفق الخلوي والتصور الحسابية يوفر طريقة بديلة وحساسة، وسهلة الاستخدام لتقييم تكوين المجتمع، لا سيما الجزء فوتواوتوتروفيك من المياه العذبة الأغشية الحيوية. فهو يتطلب إعداد العينة الأساسية فقط، بعدها يتم تشغيل نموذج كامل عن طريق سيتوميتير تدفق. يتم استخدام المعلومات البصرية ونيون خلية واحدة للتصور الحسابية والتفسير البيولوجي. مميزاتها الرئيسية عبر طرق أخرى هي سرعة التحليل وطبيعة عالية-معلومات-المحتوى. التدفق الخلوي ويقدم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية وبيوفيلم في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، محتوى اللاأحيائية في بيوفيلم، والمعلومات التصنيفية الخشنة. بيد أنه لا يقدم معلومات عن تكوين بيوفيلم على مستوى الأنواع. ونحن نرى إمكانية كبيرة في استخدام طريقة للرصد البيئي للنظم الإيكولوجية المائية كتقييم أولى بيوفيلم مفصلة الخطوة التي يبلغ مجرى النهر التحقيقات بأساليب متكاملة وأكثر تفصيلاً.

استخدام الإجراء المعروضة هنا (الشكل 1)، تم تحليل العينات المأخوذة من عدة مواقع لتيار المحلية في سويسرا. في كل موقع، واتخذت ثلاثة أحجار الحجم مماثلة (10-12 سم)، والأغشية الحيوية كانت تجاهلت الحجارة. العينات كانت ثم سونيكاتيد والثابتة، وتصفيتها وتحليلها في وق?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry at JoVE.com

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

توصيف الأغشية الحيوية المائية مع التدفق الخلوي

التدفق الخلوي في تركيبة مع المجموعات المرئية يوفر وسيلة سهلة الاستخدام وسريعة لدراسة الأغشية الحيوية المائية. يمكن استخدامه لتوصيف بيوفيلم، الكشف عن التغيرات في هيكل المجتمع بيوفيلم، والكشف عن الجسيمات اللاأحيائية جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم.

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

This method can help to answer key questions in the field of environmental sciences, such as impacts of chemical pollution or climate change in aquatic ecosystems. The main advantage of this technique is that all the individual steps are simple and fast to perform. Although the focus of the procedure is to characterize autotrophic biofilms, it can also be used to characterize heterotrophic biofilms and detect particle pollutants such as microplastics.To begin, select an aquatic sampling site where biofilm grow, these are typically shallow parts of streams that have slow to intermediate water flow and stony streambeds. If the site doesn't have enough surface for biofilm attachment, you can use artificial substrates where biofilms can grow on. Measure the environmental conditions at the sampling site using portable instruments to measure conductivity, pH, water temperature and light intensity right above the surface of the biofilm to be sampled.Using protective gloves, collect stones that are similar in size, shape, and type from each site. The stones should be collected from areas that are exposed to similar flow and light conditions. In addition to biofilm sample collection and the measurement of the growth conditions on site, obtain water samples to measure water chemistry parameters.To process the biofilm samples, first filter 15 milliliters of stream water from the site through a 0.22-micrometer filter. Then, use a soft toothbrush to remove the biofilm from the substrate until it is completely suspended in a flask. Fix the biofilm samples using 0.01%paraformaldehyde and 0.1%glutaraldehyde.Transfer subsamples of the biofilm to a light microscope. Turn to the appropriate magnification for your sample and identify the species present in the biofilm samples. Prepare cultures for the individual species.Grow them continuously using similar environmental conditions to the environment where the biofilm samples were taken from. Once grown, disperse the cells by sonicating them for five to 10 seconds at 45 kilohertz. Place the dispersed cells into a 96-well plate.Once dispersed, record the absorbance and fluorescence spectra of the single species using a plate reader. Next, set up the flow cytometer with dichroic splitters and filters to cover the fluorescent ranges in which the different species were found to have specific properties. To prepare a single-species reference, use the optimized flow cytometry parameters to measure the optical and fluorescent properties of single species.Next, prepare damaged and decaying cells by taking a one milliliter subsample of diluted biofilm, centrifuging it at 8, 000 g for 10 minutes, and then re-suspending the pellet in one milliliter of 90%ethanol. Store the suspension overnight at four degrees Celsius, and repeat the process again the next day. Using the same optimized flow cytometry settings, measure the optical and fluorescent properties of the damaged and decaying cells.After setting the flow cytometer parameters and constructing the reference database, it's time to start collecting samples for the monitoring campaign. The samples should be collected and processed as was shown in previous steps, with the exception that sonication should take one minute at 45 kilohertz. Once ready to analyze, take samples from storage.To avoid blocking the flow cytometer, filter the subsamples through 50-micrometer pore filters, then load one to two milliliters of the individual samples into the flow cytometer and measure the optical and fluorescent properties of each particle. Repeat the measurement three times for each sample. Open MATLAB and run CYT as a toolbox.Then, import the reduced flow cytometry data as a csv file into the CYT software. Next, use the hyperbolic arcsine transformation to transform the fluorescent channels of all the samples. Enter 150 as the value of the co-factor.This value works for most phototrophic biofilms and flow cytometers, but optimization might be necessary. For quality control, plot and visually compare the histograms of individual samples and individual optical and fluorescent channels to make sure there are no outliers at the technical and biological level of replication. Outliers will manifest in significantly shifted fluorescent optical distributions between the replicates.Next, merge the technical replicates in each biological replicate and subsample the biological replicates so that each is represented by the same number of particles. The ideal number of particles analyzed by Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding is around 150, 000. For comparison between samples, select only those samples that are to be compared and run Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding.Once the algorithm is finished, new channels, named bh-SNE1 and bh-SNE2, appear. Visualize the data from the resulting channels as a scatter plot to show all of the Stochastic Neighbor Embedding coordinates containing all of the analyzed particles. If the clusters are not visually separable, too many or not enough particles were probably used in the analysis.Adjust the number of particles and repeat the analysis. In the viSNE map, particles are positioned according to similarity and grouped into visually separable clusters. Inspect the optical fluorescent properties of the clusters and mark and name those that are well separated and have different properties using the drawing tools.For subsequent statistical analysis, export the viSNE clusters into MATLAB. Using the procedure presented here, samples taken from several sites of a local stream in Switzerland were analyzed. Using viSNE maps, it is possible to distinguish between different environmental biofilms.Here six different samples feature different densities in various parts of the viSNE map. The viSNE maps shown here are populated by particles with different optical and fluorescence properties that give clues to the biotic/abiotic origin of the particles and to which taxonomic group to which the biotic particles belong. Additionally, projection of the reference database onto the viSNE map can help interpret which parts of the map are populated by which taxa and/or abiotic particles.It can also establish which subpopulations are different between the samples. Here, the number of particles for each subpopulation are shown for each of the different biological replicates. Once mastered, this technique can be done in two hours from sample collection to finished analysis.Following this procedure, other methods such as fluorescence-activated cell sorting can be used to validate the predictions of the visual clustering. After watching this video, you should have a good understanding how to use flow cytometry and visual clustering to analyze aquatic biofilms.

Research

JoVE Journal

Environment

Waste Water Derived Electroactive Microbial Biofilms: Growth, Maintenance, and Basic Characterization

The growth of anodic electroactive microbial biofilms from waste water inocula in a fed-batch reactor is demonstrated using a three-electrode setup ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

توصيف وتطبيق العينات سلبية لمراقبة المبيدات في المياه

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

طريقة بديلة لإزالة Otoliths من سمك الحفش

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

نظام التعرض تدفق من خلال لتقييم موقوف الرواسب التأثيرات على الحياة المائية

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Improving Infrared Spectroscopy Characterization of Soil Organic Matter with Spectral Subtractions

تحسين توصيف مطيافية الأشعة تحت الحمراء للمواد العضوية في التربة مع الطرح الطيفي

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

بروتوكول تجريبي لفحص ملفات تعريف الاستجابة السلوكية في الأسماك اليرقات: تطبيق على الكافيين منشط للأعصاب

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Sampling, Sorting, and Characterizing Microplastics in Aquatic Environments with High Suspended Sediment Loads and Large Floating Debris

أخذ العينات، والفرز، وتميز ميكروبلاستيكس في البيئات المائية مع أحمال الرواسب المعلقة عالية وكبيرة من الحطام العائم

The ubiquitous presence of plastic debris in the ocean is widely recognized by the public, scientific communities, and government agencies. However, only ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

البكتيريا التي تحمل علامة الفلورسنت كجهاز تتبع للكشف عن مسارات جديدة لتدفق الكربون العضوي في النظم الإيكولوجية المائية

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...