Name: characterization of aquatic biofilms with flow cytometry
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00
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Die vorgestellte Arbeit wurde von einem SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) und ein Velux-Forschungsstipendium (Amplebig) unterstützt. Wir möchten Bettina Wagner für Hilfe bei der experimentellen Arbeit zu danken.

(1) Ökosystem Auswahl und Biofilm-Sampling
<ol><li>Wählen Sie eine aquatische Ökosystem von Interesse und finden Sie Probenahmestellen wo Biofilme wachsen zu. Flache Teile eines Baches mit langsam zum Medium Wasser fließen und einen steinigen Flussbett zur Befestigung der Biofilm sind geeignete17,18.</li>
	<li>Optional: Wenn die Website nicht genügend Flächen zur Befestigung der Biofilm zu verringern und einen die Biofilme Variabilität innerhalb einer We...

<ol>
	<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stressors+in+periphyton+-+comparison+of+observed+and+predicted+tolerance+responses+to+high+ionic+loads+and+herbicide+exposure.">Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure.</a> J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollution-induced+community+tolerance+(PICT):+towards+an+ecologically+relevant+risk+assessment+of+chemicals+in+aquatic+systems.">Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems.</a> Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).</li><li>Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mine+of+information:+Benthic+algal+communities+as+biomonitors+of+metal+contamination+from+abandoned+tailings.">A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings.</a> Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).</li><li>Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+chronic+and+acute+pesticide+exposures+on+periphyton+communities.">Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities.</a> Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).</li><li>Dorigo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lotic+biofilm+community+structure+and+pesticide+tolerance+along+a+contamination+gradient+in+a+vineyard+area.">Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area.</a> Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).</li><li>Pesce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+single+and+joint+toxic+effects+of+diuron+and+its+main+metabolites+on+natural+phototrophic+biofilms+using+a+pollution-induced+community+tolerance+(PICT)+approach.">Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach.</a> Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).</li><li>Ricart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+low+concentrations+of+the+phenylurea+herbicide+diuron+on+biofilm+algae+and+bacteria.">Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria.</a> Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).</li><li>Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf-litter+leachate+concentration+promotes+heterotrophy+in+freshwater+biofilms:+Understanding+consequences+of+water+scarcity.">Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity.</a> Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).</li><li>Corcoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+comprehensive+assessment+of+16S+rRNA+bacterial+diversity+in+marine+biofilms+using+high-throughput+sequencing.">Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing.</a> Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).</li><li>Welsh, A. K., McLean, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacteria+in+mixed+biofilm+communities+using+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+(DGGE).">Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).</a> Curr Protoc Microbiol. , (2007).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+Biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability.</a> Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+periphyton+using+liquid+chromatography-organic+carbon+detection-organic+nitrogen+detection+(LC-OCD-OND).">Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND).</a> Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).</li><li>Kroll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+messages+from+benthic+microbial+communities+exposed+to+nanoparticulate+and+ionic+silver:+3D+structure+picks+up+nano-specific+effects,+while+EPS+and+traditional+endpoints+indicate+a+concentration-dependent+impact+of+silver+ions.">Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions.</a> Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).</li><li>Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+combined+with+viSNE+for+the+analysis+of+microbial+biofilms+and+detection+of+microplastics.">Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics.</a> Nat Commun. 7, 11587 (2016).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+the+biofilm+concept+and+types+of+aquatic+biofilms.">Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms.</a> Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).</li><li>Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+disturbance+history+affects+patchiness+of+benthic+river+algae.">Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae.</a> Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).</li><li>Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropollutant-induced+tolerance+of+in+situ+periphyton:+Establishing+causality+in+wastewater-impacted+streams.">Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams.</a> Water Res. 111, 185-194 (2017).</li><li>Robinson, C. T., Rushforth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physical+disturbance+and+canopy+cover+on+attached+diatom+community+structure+in+an+idaho+stream.">Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream.</a> Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).</li><li>Pomati, F., Nizzetto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+triclosan-induced+ecological+and+trans-generational+effects+in+natural+phytoplankton+communities:+A+trait-based+field+method.">Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method.</a> Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).</li><li>Hulliger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgew&#228;sser. , (2007).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+spatio-temporal+changes+in+pollution-induced+community+tolerance+to+zinc+in+autotrophic+and+heterotrophic+biofilm+communities.">In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities.</a> Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).</li><li>Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sonication+on+bacteria+viability+in+wastewater+treatment+plants+evaluated+by+flow+cytometry+-+Fecal+indicators,+wastewater+and+activated+sludge.">Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge.</a> Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).</li><li>Buesing, N., Gessner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+detachment+procedures+for+direct+counts+of+bacteria+associated+with+sediment+particles,+plant+litter+and+epiphytic+biofilms.">Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms.</a> Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+t-SNE+using+Tree-Based+Algorithms.">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li></ol>

Das oben beschriebene Protokoll ist relativ einfach zu implementieren. Während die vorgestellten Standardeinstellungen für alle phototrophe Biofilm getestet bisher geeignet gezeigt wurden, ist jedoch Optimierung (wie im Protokoll beschrieben) notwendig, die Informationen aus der Methode zu maximieren. In der Tat, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften von Biofilmen können variieren, abhängig von den Umgebungsbedingungen (Jahreszeit, Temperatur, chemische Zusammensetzung des Wassers)1...

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine in Süßwasser-Ökosystemen, Primärproduktion Schlüsselrolle, nährstoffkreisläufe und Wasseraufbereitung bis hin zu beeinflussen die Verteilung der Mikroorganismen und ihrer Artenvielfalt des Ökosystems 1. wenn Biofilme an sich verändernde Umweltbedingungen oder Stressoren, wie Chemikalien, ausgesetzt sind rückt die Gemeinschaftsstruktur schnell toleranter Arten2,3. Ihre hohe Empfindlichkeit verwandelt sich Biofilme in attraktive Modellsysteme für ökologische Überwachung4, jedoch keine der aktuellen Methoden perfekt geeignet ist, um die Dynamik einer Biofilm-Gemeinschaft tatsächlich in eine schnelle und einfache Weise zu verfolgen.
Die häufig verwendete Satz von Methoden zur Charakterisierung von Biofilmen besteht aus der Messung der funktionellen und strukturellen Endpunkte. Auf der Ebene der gesamten Gemeinschaft enthält Photosynthese und Atmung sowie die Aktivität extrazellulärer Enzyme Informationen über den Funktionszustand der Biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse-Abgrenzung dient als Indikator für Gesamtwachstum Biofilm. Strukturelle Veränderungen sind derzeit entweder mit traditionellen speziesidentifizierung mit Lichtmikroskopie oder Nukleotid-basierte Techniken (z.B.Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), automatisierte ribosomale intergenetischer Distanzstück gemessen. Analyse (ARISA), Metagenomik)10,11,12. Diese Methoden informieren, sondern sind zeitaufwendig, durchzuführen, oder erfordern spezielle Kenntnisse oder sind noch in der Entwicklungsphase. Schließlich neue Methoden zur Bewertung der extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)13,14 und der Biofilm Architektur1, während der empfindlichen, sind niedrig-Durchsatz und noch nicht in Richtung entwickelt worden Überwachungszwecke.
Es ist offensichtlich, dass für eine vollständige Charakterisierung von Süßwasser Biofilmen, es notwendig ist, verschiedene Methoden, die Einblick in die Biofilm-Funktion, die Zusammensetzung und die Architektur zu kombinieren. Für die Umweltüberwachung, auf der anderen Seite ist eine schnelle und empfindliche Methode, die ist erkennen Veränderungen im Biofilm und ermöglichen grundlegende biologische Deutung der Verschiebungen auf die funktionellen und strukturellen Ebene, erforderlich.
Wir haben eine neue Methode zur Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft der phototrophe Komponente von Stream Biofilmen (Periphyton), entwickelt, ist schnell genug für Überwachungszwecke und gleichzeitig ausreichend informiert über den Biofilm-Gemeinschaft Struktur, biologische Deutung15zu ermöglichen. Es basiert auf einzellige Durchflusszytometrie (FC) der Biofilm Proben und gepaart mit computergestützten Visualisierung und bietet Informationen über optische und fluoreszierende Eigenschaften des Biofilms auf der Ebene der einzelnen Zelle.
Der Workflow nach der Probenahme Biofilm besteht der Probenvorbereitung in Form von Beschallung, Fixierung und Größe-basierte Filterung der Proben, gefolgt von der Beurteilung der Probenmaterials durch Durchflusszytometrie. Die erfassten Daten geben Auskunft über mehrere zellulären Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte (z. B. mikroplastik) im Biofilm. Dieser Satz von Daten ist als über computergestützte Visualisierung mit visuellen stochastische Nachbar einbetten (ViSNE)16, ermöglicht schnelle und einfache Interpretation der Daten analysiert. Obwohl ein paar Wochen erforderlich sind, um einrichten und optimieren die Methode einmal eingerichtet, es dauert nur wenige Stunden von den Biofilm Probenahmen zur Interpretation der Ergebnisse.
Die wichtigsten Vorteile der vorgestellten Methode gegenüber anderen sind die Geschwindigkeit der Analyse und hohen Informationsgehalt. Darüber hinaus können die Proben für mehrere Wochen nach der Entnahme ohne Verlust von ihren optischen und Fluoreszenzeigenschaften gespeichert werden. Dies kann sehr nützlich sein bei der Charakterisierung von einer großen Anzahl von Proben ist erforderlich, wie z. B. große Stichproben Studien oder Biomonitoring-Programme, sondern bieten auch eine beträchtliche Menge an Informationen in kleinere explorative Studien.
Die vorgestellte Protokoll basiert auf Fluss-durchflusszytometrischen Analyse von phototrophe Biofilmen (Periphyton) von verschiedenen Standorten eines Baches gesammelt. Viele Schritte des Protokolls, z. B. die Auswahl der Standorte für Überwachungszwecke, die Ziele der Forschung abhängig und daher können nicht verordnet werden. Andere weniger Freiheit ermöglichen und erfordern, dass das Protokoll aufmerksam verfolgt, wird in das ausführliche Protokoll unten deutlich.
Das Protokoll beginnt mit der Auswahl der Standorte für Biofilm-basiertes Umweltmonitoring. Der nächste Schritt ist Setup Durchflusszytometer (FC), so dass seine Messungen Diskriminierung zwischen verschiedenen phototrophe Organismen in Biofilmen in der überwachten Umgebung ermöglichen. Dies erfolgt durch das Sammeln von Biofilm-Proben von den Sites, identifizieren die fluoreszierenden Eigenschaften der verschiedenen Arten in den Biofilm und Einrichten der Durchflusszytometer mit Laser und Filter, die Messung an den entsprechenden optischen aktivieren Wellenlängen. Nachdem die FC Aufbau wurde, können Biofilme werden gesammelt von den Seiten in regelmäßigen Abständen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Partikel in den Biofilm-Durchflusszytometrie gemessen und die Daten analysiert durch visuelle clustering. Für bessere Interpretation der Ergebnisse ist es möglich, eine FC-Referenzdatenbank von lokalen Biofilm-Lebewesen und ihre Phänotypen zu bauen und die Datenbank verwenden, um verschiedene Taxonomien in den FC-Daten zu identifizieren. Die Validierung ist möglich durch Fluoreszenz basierende Sortierung der identifizierten Cluster von Einzelzellen mit FACS und Mikroskopie-basierte taxonomische Identifizierung der vorliegenden Art. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1aufgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1095">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Multimeter</td>
			<td style="width:123px;">WTW</td>
			<td style="width:344px;">MultiLine 3620 IDS</td>
			<td style="width:413px;">For measuring temperature, pH, dissolved oxygen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>97043-986</td>
			<td>Tank dimesions: 15*14*10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td style="width:413px;">Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td>used for selecting appropriate setting of the FC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:123px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:344px;">MoFlo Astrios</td>
			<td style="width:413px;">Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 135</td>
			<td style="width:413px;">Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2013a</td>
			<td>software for numerical computing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CYT</td>
			<td>Dana Pe&#39;er Lab</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>free interactive visualization tool for analysis of cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of aquatic biofilms with flow cytometry

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine Schlüsselrolle in Süßwasser-Ökosystemen spielen. Durch die Veränderung ihrer Gemeinschaftsstruktur, Biofilmen schnell auf Veränderungen der Umwelt reagieren und können somit als Indikatoren für die Qualität des Wassers verwendet werden. Derzeit basiert Biofilm Bewertung meist auf integrative und funktionalen Endpunkte wie photosynthetische oder Atemwege Tätigkeit, die keine Informationen über die Struktur der Biofilm-Gemeinschaft bieten. Durchflusszytometrie und computergestützte Visualisierung bieten eine alternative, sensibel und leicht zu bedienende Methode zur Beurteilung der Gemeinschaft Zusammensetzung, insbesondere von den photoautotrophen Teil von Süßwasser Biofilmen. Es erfordert nur grundlegende Probenvorbereitung, nach deren Ablauf die gesamte Probe durch das Durchflusszytometer ausgeführt ist. Die einzelligen optische und fluoreszierende Informationen wird für computergestützte Visualisierung und biologischen Interpretation verwendet. Die wichtigsten Vorteile gegenüber anderen Methoden sind die Geschwindigkeit der Analyse und der hohe Informationsgehalt Natur. Durchflusszytometrie liefert Informationen über verschiedene Zell- und Biofilm Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte in den Biofilm und groben taxonomische Informationen. Jedoch bietet es keine Informationen über Zusammensetzung der Biofilm auf Artniveau. Wir sehen hohes Potential bei der Verwendung der Methode für die Umweltüberwachung aquatischer Ökosysteme und als erste Biofilm Evaluation Schritt, die stromabwärts informiert detaillierte Untersuchungen durch ergänzende und genauere Methoden.

Mit dem Verfahren hier vorgestellten (Abbildung 1), wurden Proben aus mehreren Standorten von einem lokalen Strom in der Schweiz analysiert. An jedem Standort drei ähnliche große Steinen (10 – 12 cm) entstanden und Biofilmen waren die Stones abgebürstet. Die Proben wurden dann beschallt, fixiert, gefiltert und später durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Setup der Durchflusszytometer und Referenz-Datenbank verwendet, waren die gleichen wie in einem...

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

This method can help to answer key questions in the field of environmental sciences, such as impacts of chemical pollution or climate change in aquatic ecosystems. The main advantage of this technique is that all the individual steps are simple and fast to perform. Although the focus of the procedure is to characterize autotrophic biofilms, it can also be used to characterize heterotrophic biofilms and detect particle pollutants such as microplastics.To begin, select an aquatic sampling site where biofilm grow, these are typically shallow parts of streams that have slow to intermediate water flow and stony streambeds. If the site doesn't have enough surface for biofilm attachment, you can use artificial substrates where biofilms can grow on. Measure the environmental conditions at the sampling site using portable instruments to measure conductivity, pH, water temperature and light intensity right above the surface of the biofilm to be sampled.Using protective gloves, collect stones that are similar in size, shape, and type from each site. The stones should be collected from areas that are exposed to similar flow and light conditions. In addition to biofilm sample collection and the measurement of the growth conditions on site, obtain water samples to measure water chemistry parameters.To process the biofilm samples, first filter 15 milliliters of stream water from the site through a 0.22-micrometer filter. Then, use a soft toothbrush to remove the biofilm from the substrate until it is completely suspended in a flask. Fix the biofilm samples using 0.01%paraformaldehyde and 0.1%glutaraldehyde.Transfer subsamples of the biofilm to a light microscope. Turn to the appropriate magnification for your sample and identify the species present in the biofilm samples. Prepare cultures for the individual species.Grow them continuously using similar environmental conditions to the environment where the biofilm samples were taken from. Once grown, disperse the cells by sonicating them for five to 10 seconds at 45 kilohertz. Place the dispersed cells into a 96-well plate.Once dispersed, record the absorbance and fluorescence spectra of the single species using a plate reader. Next, set up the flow cytometer with dichroic splitters and filters to cover the fluorescent ranges in which the different species were found to have specific properties. To prepare a single-species reference, use the optimized flow cytometry parameters to measure the optical and fluorescent properties of single species.Next, prepare damaged and decaying cells by taking a one milliliter subsample of diluted biofilm, centrifuging it at 8, 000 g for 10 minutes, and then re-suspending the pellet in one milliliter of 90%ethanol. Store the suspension overnight at four degrees Celsius, and repeat the process again the next day. Using the same optimized flow cytometry settings, measure the optical and fluorescent properties of the damaged and decaying cells.After setting the flow cytometer parameters and constructing the reference database, it's time to start collecting samples for the monitoring campaign. The samples should be collected and processed as was shown in previous steps, with the exception that sonication should take one minute at 45 kilohertz. Once ready to analyze, take samples from storage.To avoid blocking the flow cytometer, filter the subsamples through 50-micrometer pore filters, then load one to two milliliters of the individual samples into the flow cytometer and measure the optical and fluorescent properties of each particle. Repeat the measurement three times for each sample. Open MATLAB and run CYT as a toolbox.Then, import the reduced flow cytometry data as a csv file into the CYT software. Next, use the hyperbolic arcsine transformation to transform the fluorescent channels of all the samples. Enter 150 as the value of the co-factor.This value works for most phototrophic biofilms and flow cytometers, but optimization might be necessary. For quality control, plot and visually compare the histograms of individual samples and individual optical and fluorescent channels to make sure there are no outliers at the technical and biological level of replication. Outliers will manifest in significantly shifted fluorescent optical distributions between the replicates.Next, merge the technical replicates in each biological replicate and subsample the biological replicates so that each is represented by the same number of particles. The ideal number of particles analyzed by Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding is around 150, 000. For comparison between samples, select only those samples that are to be compared and run Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding.Once the algorithm is finished, new channels, named bh-SNE1 and bh-SNE2, appear. Visualize the data from the resulting channels as a scatter plot to show all of the Stochastic Neighbor Embedding coordinates containing all of the analyzed particles. If the clusters are not visually separable, too many or not enough particles were probably used in the analysis.Adjust the number of particles and repeat the analysis. In the viSNE map, particles are positioned according to similarity and grouped into visually separable clusters. Inspect the optical fluorescent properties of the clusters and mark and name those that are well separated and have different properties using the drawing tools.For subsequent statistical analysis, export the viSNE clusters into MATLAB. Using the procedure presented here, samples taken from several sites of a local stream in Switzerland were analyzed. Using viSNE maps, it is possible to distinguish between different environmental biofilms.Here six different samples feature different densities in various parts of the viSNE map. The viSNE maps shown here are populated by particles with different optical and fluorescence properties that give clues to the biotic/abiotic origin of the particles and to which taxonomic group to which the biotic particles belong. Additionally, projection of the reference database onto the viSNE map can help interpret which parts of the map are populated by which taxa and/or abiotic particles.It can also establish which subpopulations are different between the samples. Here, the number of particles for each subpopulation are shown for each of the different biological replicates. Once mastered, this technique can be done in two hours from sample collection to finished analysis.Following this procedure, other methods such as fluorescence-activated cell sorting can be used to validate the predictions of the visual clustering. After watching this video, you should have a good understanding how to use flow cytometry and visual clustering to analyze aquatic biofilms.

Research

JoVE Journal

Environment

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Forschung

Umwelt

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