Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Vi takker Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California i Berkeley for massespektrometri analyse og nyttige kommentarer. Vi takker Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutter for biologiske videnskaber, kinesiske Academy of Sciences, Shanghai, Kina for at give en fuld-længde CENP-F-konstruktion. Endelig, vi takker Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan og Dr. Christof Grewer på Binghamton Universitet for adgang til udstyr. Denne forskning blev finansieret af instituttets forskning for State University of New York og Institut for kemi, State University of New York på Binghamton.

1. forudsigelse af Cdk1-specifikke fosforylering websteder fra Protein sekvens
<ol><li>Før du begynder kinase assay, analysere protein sekvensen for forventede Cdk1-specifikke fosforylering websteder og Søg litteratur for eksperimentelt etablerede fosforylering websteder med ukendt kinase specificitet. Brug følgende værktøjer, databaser og referencer, der opsummeres.<ol>
<li>Bruge BGB 3.0 software36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) til at foru...

Vores in vitro- kinase assay er en meget kraftfuld metode til at identificere molekylære mål for kinase Cdk1, som er en master controller af cellecyklus og regulerer mange vigtige cellulære processer. Metoden bestemmer, om et oprenset protein er et substrat for Cdk1 og giver mulighed for identificering af specifikke fosforylering websteder. Dette letter Mekanistiske undersøgelser for regulering af cellulære processer ved fosforylering gennem Cdk1.
Den mest kritiske faktor for suc...

Kinaser er enzymer, overføre fosfat grupper fra ATP på substrater og regulere mange cellulære processer. Denne fosforylering er reversibel, hurtigt, tilføjer to negative afgifter, og gemmer fri energi og er en af de mest almindelige posttranslationelle modifikationer bruges af celler. Cdk1, som er også kendt som celledeling cyklus protein 2 homolog (cdc2) er en master controller til cellecyklus i alle eukaryoter1,2,3,4,5, og phosphorylates en anslåede 8-13% af proteomet6,7.
Mens de seneste proteom undersøgelser har identificeret mange fosforylering websteder i proteiner, i de fleste tilfælde er kinase ansvarlig for disse ændringer ukendt. Antallet af kendte Cdk1 mål, især i humane celler er lav7. Identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder er vigtigt, da det giver Mekanistiske undersøgelser, at fastslå, hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus. Celle cyklus regulering er vigtig for trofaste kromosom segregation og celledeling, og et utal af cellulære processer skal ske for at støtte denne vigtige fysiologiske funktion. Dette omfatter standse transskription og translation forud for mitosen, såvel som en dramatisk reorganisering i cellulære struktur og organisation, som demontering af nukleare kuvert, kromosom kondens og mitotiske spindel forsamling. Deregulering og fejl i disse processer medføre kræft, fosterskader eller mitotiske celledød. Specifikke hæmmere af Cdk1 som RO-3306 var udviklede8, som give kraftfulde værktøjer for funktionelle studier, og nogle af disse inhibitorer er i øjeblikket i kliniske forsøg til behandling af cancer (Se9 til gennemsyn).
Her, beskriver vi en in vitro- kinase assay der tillader identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder. I denne analyse, er kommercielt tilgængelige menneskelige Cdk1/cyclin B bruges til at phosphorylate en renset target protein in vitro. Fosforylering af et substrat øger dens masse og tilføjer to negative afgifter; Derfor, vellykket fosforylering er bekræftet af en opadgående skift af protein gel band på SDS-PAGE. Cdk1-specifikke fosforylering websteder er efterfølgende identificeret ved massespektrometri analyse af in vitro- fosforyleret protein. Hjælp med eksperimentelle design, gennemgå vi også beregningsmæssige redskaber og referencer til forudsigelse af Cdk1-specifikke fosforylering websteder fra protein sekvens. Derudover beskriver vi også rensning protokoller, der giver meget rene og homogen protein præparater egnet til kinase assay. Endelig identificeret fosforylering websteder skal verificeres af funktionelle studier, og en enkel bindende assay er beskrevet her til dette formål. Kombinerede, er dette en meget kraftfuld tilgang, der giver Cdk1-specifikke fosforylering websteder og muliggør Mekanistiske undersøgelser i hvordan Cdk1 styrer celle cyklus7,10,11. Da denne metode er baseret på rensede proteiner, kan det anvendes på enhver model organisme og udbytter pålidelige resultater. Dog funktionelle verifikation af opnåede fosforylering websteder i vitro anbefales, da cellerne har yderligere lovgivningsmæssige mekanismer på plads, såsom posttranslationelle modifikationer, interaktion partnere eller cellulære lokalisering, kan gengive fosforylering websteder tilgængelige eller utilgængelige for anerkendelse af Cdk1.
Cdk1 genkender en konsensus fosforylering websted, der består af (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), hvor X er nogen rester og en Serin eller Threonin er stedet for fosforylering. Især vigtigt for anerkendelse er tilstedeværelsen af prolin i positionen + 1. Desuden grundlæggende restkoncentrationer foretrækkes i + 2 eller 3 positioner, med de fleste Cdk1-specifikke fosforylering websteder, der indeholder en Lys eller Arg på + 3 Placer6,12.
Aktivering af Cdk1 er stramt reguleret og fører til udbrud af mitosen1,2,3,4,5. Aktiviteten af cyclin-afhængig kinaser afhænger generelt af deres tilknytning til forskellige cyclins (cyclin A, B, C, D og E i mennesker), som er udtrykt på oscillerende niveauer i hele cellecyklus13. Cdk1 udtryk er konstant i hele cellecyklus og regulering af dens aktivitet er afhængig af sin tilknytning til de lovgivningsmæssige underenheder cyclin A og cyclin B5,13,14,15, som samt posttranslationelle modifikationer. Dannelsen af Cdk1/cyclin B kompleks er nødvendig for kinase aktivering5,14,15,16,17,18. I fasen G2 er cyclin B oversat i cytosol og importeres til kernen hvor det binder sig til Cdk15,14,15,16,17,18; men Cdk1/cyclin B afholdes inaktiveret ved fosforylering på rester Thr14 og Tyr15 af de menneskelige Cdk1-hæmmende kinaser Myt1 (membran-associerede tyrosin og Threonin-specifikke cdc2-hæmmende kinase) og Wee1, henholdsvis19, 20,21. I den sene G2 fase, dephosphorylation af Thr14 og Tyr15 ved celledeling cyklus 25 fosfatase (cdc25) aktiverer kinase aktivitet af Cdk1/cyclin B kompleks og udløser indledningen af mitosen12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforylering af Thr161 er også påkrævet til Cdk1/cyclin B aktivering og er medieret af Cdk7, aktivering af Cdk kinase (KAG)18. Nedbrydning af cyclin B i anaphase inaktiverer Cdk1, tillader exit fra mitosen24,25. Aktivering af Cdk1/cyclin B er derfor en kompliceret proces. Protokollen præsenteres her er udført med kommercielt tilgængelige Cdk1/cyclin B. Under rekombinant udtryk for dette kompleks i insekt celler, det er aktiveret i vivo endogene kinaser14,20 og forbliver aktive i den rensede tilstand. Den resulterende aktive, rekombinant human Cdk1/cyclin B er velegnet til in vitro- kinase assays.
Her, beskriver vi en protokol for kortlægning af Cdk1 specifikke fosforylering websteder i menneskelige centromer protein F (CENP-F)10. CENP-F er et kinetochore protein, der findes i kernen i det meste af interphase (G1 og S-fasen) og eksporteres til cytosol i G2 fase26,27,28 i en Cdk1-afhængige måde10, 11. nukleare lokalisering er tillagt en todelt cNLS26. cNLSs genkendes af nukleare transport faktor karyopherin α, som letter karyopherin β og RanGDP, import af cNLS-cargo til kernen29. Nuklear eksport i fasen G2 lettes via en ukendt eksport vej10. Når CENP-F er placeret i cytosol, det er rekrutteret til den nukleare kuvert og rekrutter igen motor protein kompleks dynein30,31. Denne vej er vigtigt at placere den respektive til centrosome kerne i indledende faser af mitotiske spindel forsamling i dynein-afhængige måde, hvilket er vigtigt for den korrekte timing af mitotiske post og en grundlæggende proces i hjernen udvikling30,31,32. Starter i fasen for G2, er CENP-F også samlet i kinetochore hvor det har vigtige roller for trofaste kromosom segregation27,28,33,34,35 . Et centrale lovgivningsmæssige skridt af disse veje er den nukleare eksport af CENP-F i G2 fase, som er afhængige af Cdk110,11. Vi beskriver her en protokol for kortlægning af Cdk1 specifikke fosforylering websteder i cNLS af CENP-F. Phosphomimetic mutationer af disse websteder bremse nukleare import af CENP-F, tyder på, at Cdk1/cyclin B direkte regulerer cellulære lokalisering af CENP-F ved fosforylering af sin cNLS10.
Samlet set tillader denne in vitro- kinase assay identifikation af specifikke substrater for kinase Cdk1. renset target proteiner er fosforyleres i in vitro af de kommercielt tilgængelige Cdk1/cyclin B kompleks og fosforylering websteder er efterfølgende identificeret ved massespektrometri. Identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder understøtter Mekanistiske undersøgelser, der afslører, hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Cyclin-afhængig kinase 1 (Cdk1) er en master controller til cellecyklus i alle eukaryoter og phosphorylates anslås 8-13% af proteomet; men antallet af identificerede mål for Cdk1, især i humane celler er stadig lav. Identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder er vigtigt, da de giver mekanistiske indblik i hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus. Celle cyklus regulering er kritisk for trofaste kromosom opdeling, og mangler i denne komplicerede proces føre til kromosomforandringer og kræft.
Her, beskriver vi en in vitro- kinase assay, der bruges til at identificere Cdk1-specifikke fosforylering websteder. I denne analyse, et oprenset protein er fosforyleres i vitro af kommercielt tilgængelige menneskelige Cdk1/cyclin B. vellykket fosforylering er bekræftet af SDS-PAGE og fosforylering websteder er efterfølgende identificeret ved massespektrometri. Vi beskriver også rensning protokoller, der giver meget rene og homogen protein præparater egnet til kinase assay, og et bindende assay funktionelle verifikation af de identificerede fosforylering websteder, som sonder samspillet mellem en klassisk nukleare lokalisering signal (cNLS) og dens nukleare transport receptor karyopherin α. Hjælp med eksperimentelle design, gennemgår vi metoder til forudsigelse af Cdk1-specifikke fosforylering websteder fra protein-sekvenser. Sammen præsentere disse protokoller en meget kraftfuld tilgang, der giver Cdk1-specifikke fosforylering websteder og muliggør Mekanistiske undersøgelser i hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus. Da denne metode er baseret på rensede proteiner, kan det anvendes på enhver model organisme og udbytter pålidelige resultater, især når den kombineres med celle funktionelle studier.

Vi har for nylig brugt en in vitro- kinase assay (figur 1) til at identificere Cdk1-specifikke fosforylering websteder i en CENP-F-fragment, der indeholdt en cNLS10. Dette signal giver nukleare lokalisering af CENP-F i det meste af interfasen. I fasen for G2 eksporteres CENP-F fra kernen til cytosol i en Cdk1-afhængige måde. For at opnå mekanistiske indsigt på hvordan Cdk1 regulerer cellulære lokalisering af CENP-F, analy...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-afhængig kinase 1 (Cdk1) er aktiveret i G2 fase af cellecyklus og regulerer mange cellulære veje. Her præsenterer vi en protokol for en in vitro- kinase assay med Cdk1, som giver mulighed for identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder til oprettelse af cellulære mål for denne vigtige kinase.

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...