Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Vi takker Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California i Berkeley for massespektrometri analyse og nyttige kommentarer. Vi takker Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutter for biologiske basalfag, kinesiske vitenskapsakademi, Shanghai, Kina for å gi en full lengde CENP-F-konstruksjon. Til slutt, vi takker Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan og Dr. Christof Grewer ved Binghamton University for tilgang til utstyr. Denne forskningen ble finansiert av Research Foundation for State University of New York og ved Institutt for kjemi, State University of New York på Binghamton.

1. prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering nettsteder fra Protein sekvensen
<ol><li>Før analysen kinase, analysere protein sekvens for predikerte Cdk1-spesifikke fosforylering områder og søke litteraturen for eksperimentelt etablerte fosforylering nettsteder med ukjent kinase spesifisitet. Bruk av følgende verktøy, databaser og referanser som summeres.<ol>
<li>Bruke IGPer 3.0 programvare36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) for å forutsi Cd...

Våre i vitro kinase analysen er en meget kraftfull metode å identifisere molekylære mål for kinase Cdk1, som er en master kontroller av cellen syklus og regulerer mange viktige cellulære prosesser. Metoden bestemmer hvis en renset protein er et medium for Cdk1 og lar identifikasjon av bestemte fosforylering nettsteder. Dette forenkler mekanistisk studier for regulering av cellulære prosesser ved fosforylering gjennom Cdk1.
Den mest kritiske faktoren for vellykket identifikasjon ...

Kinaser er enzymer som overføre fosfat grupper fra ATP på underlag og regulere mange cellulære prosesser. Denne fosforylering reversibel, rask, legger to negative kostnader, og lagrer fri energi og er en av de vanligste posttranslational modifikasjonene brukes av celler. Cdk1, som kalles også cellen divisjon syklus protein 2 homolog (cdc2) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter1,2,3,4,5, og phosphorylates en anslagsvis 8-13% av proteom6,7.
Mens proteomic studier har identifisert mange fosforylering nettsteder i proteiner, oftest er kinase ansvarlig for disse endringene ukjent. Antall kjente Cdk1 mål, spesielt i menneskeceller er lav7. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder er viktig, ettersom mekanistisk studier som etablerer hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Cellen syklus regulering er viktig for trofast kromosom segregering og celledeling, og et mylder av cellulære prosesser må skje for å støtte denne viktige fysiologiske funksjon. Dette inkluderer stanse transkripsjon og oversettelse før utbruddet av mitose, samt en dramatisk omorganisering i cellestruktur og organisasjon, for eksempel demontering av kjernefysiske konvolutten, kromosom kondens og mitotisk spindelen montering. Dereguleringen og feil i prosessene føre til kreft, fødsel defekter eller mitotisk celledød. Bestemt hemmere av Cdk1 som RO-3306 var utviklet8, som gir kraftige verktøy for funksjonell studier, og noen av disse hemmere finnes i kliniske studier for kreftbehandling (se9 for gjennomgang).
Her beskriver vi i vitro kinase analysen som gjør identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder. I denne analysen, tilgjengelige menneskelige Cdk1/cyclin B til å phosphorylate en renset målet protein i vitro. Fosforylering av et øker sin masse og legger to negative kostnader; Derfor er vellykket fosforylering bekreftet av et skift oppover i protein gel bandet på SDS-siden. Cdk1-spesifikk fosforylering nettsteder identifiseres senere massespektrometri analyse av proteinet i vitro fosforylert. For å hjelpe med eksperimentell design, se vi også beregningsorientert verktøy og referanser for prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder fra protein sekvensen. I tillegg beskriver vi også rensing protokoller som gir svært rent og homogen protein forberedelser egnet for kinase analysen. Endelig identifisert fosforylering nettstedene må verifiseres av funksjonelle studier, og en enkel binding analysen er beskrevet her for dette formålet. Kombinert, er dette en svært kraftig tilnærming som gir Cdk1-spesifikke fosforylering områder og aktiverer mekanistisk studier i hvordan Cdk1 styrer celle syklus7,10,11. Siden denne metoden er avhengig av renset proteiner, kan det brukes på alle modell organismen og gir pålitelige resultater. Men funksjonell bekreftelse for innhentet fosforylering nettsteder vitro anbefales celler har ytterligere regulatoriske mekanismer sted, for eksempel posttranslational modifikasjoner, samhandling partnere eller mobilnettet lokalisering som kan gjøre fosforylering nettsteder tilgjengelige eller utilgjengelige for anerkjennelse av Cdk1.
Cdk1 gjenkjenner en konsensus fosforylering område som består av (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), der X er noen rester og en serine eller threonin er stedet for fosforylering. Spesielt viktig for anerkjennelse er tilstedeværelsen av proline i posisjon 1. I tillegg grunnleggende rester er foretrukket i 2 eller 3 posisjoner, med de fleste Cdk1-spesifikke fosforylering områder som inneholder et Lys eller Arg på 3 posisjon6,12.
Aktivering av Cdk1 er strengt regulert og fører til utbruddet av mitose,1,,2,,3,,4,,5. Aktiviteten til cyclin-avhengige kinaser er generelt avhengig av tilknytningen forskjellige cyclins (cyclin A, B, C, D og E hos mennesker), som er uttrykt ved oscillerende nivåer gjennom cellen syklus13. Cdk1 uttrykk er konstant over cellen syklus og regulering av sin aktivitet er avhengig av tilknytningen til de regulatoriske underenheter cyclin A og cyclin B5,13,14,15, som samt post-translasjonell endringer. Dannelse av Cdk1/cyclin B komplekset er nødvendig for kinase aktivisering5,14,15,16,17,18. Den G2 fasen, er cyclin B oversatt i stoffer og importert til kjernen der det binder seg til Cdk15,14,15,16,17,18; men holdes Cdk1/cyclin B deaktivert ved fosforylering på rester Thr14 og Tyr15 av de menneskelige Cdk1-hemmende kinaser Myt1 (membran-assosiert tyrosin - og threonin-spesifikk cdc2-hemmende kinase) og Wee1, henholdsvis19, 20,21. I slutten G2 fase, dephosphorylation Thr14 og Tyr15 av cellen divisjon syklus 25 fosfatase (cdc25) aktiverer kinase aktiviteten til Cdk1/cyclin B-komplekset og utløser initiering av mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforylering i Thr161 er også nødvendig for Cdk1/cyclin B aktivisering og er formidlet av Cdk7, Cdk-aktivere kinase (CAK)18. Nedbrytning av cyclin B i anaphase deaktiverer Cdk1, slik at exit fra mitose24,25. Aktivering av Cdk1/cyclin B er derfor en komplisert prosess. Protokollen presenteres her er utført med kommersielt tilgjengelige Cdk1/cyclin B. Under rekombinant uttrykk for dette komplekset i insekt celler, det er aktivert i vivo av endogene kinaser14,20 og forblir aktiv i renset staten. Den resulterende aktive, rekombinant menneskelige Cdk1/cyclin B er egnet for i vitro kinase analyser.
Her beskriver vi en protokoll for identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder i menneskelig centromere protein F (CENP-F)10. CENP-F er en kinetochore protein som finnes i kjernen under mesteparten av interphase (G1 og S-fase) og eksporteres til stoffer i G2 fase26,27,28 i en Cdk1-avhengige måte10, 11. kjernefysiske lokalisering er gitt av en bipartite cNLS26. cNLSs gjenkjennes av kjernefysiske transport faktor karyopherin α, som letter, karyopherin β og RanGDP, import av cNLS-Last i kjernen29. Kjernefysisk eksport i G2 fase muliggjøres via en ukjent eksport veien10. Når CENP-F ligger i stoffer, det er rekruttert til den kjernefysiske konvolutten og rekrutterer igjen motor protein kompleks dynein30,31. Denne veien er viktig å plassere kjernen respektive til centrosome under innledende stadier av mitotisk spindelen montering i en dynein-avhengige måte, som er viktig for riktig tidspunkt mitotisk posten og en grunnleggende prosess i hjernen utvikling30,31,32. Starter i G2 fase, er CENP-F også samlet inn i kinetochore der det er viktige roller for trofast kromosom segregering27,28,33,34,35 . Et viktige forskrifter skritt av disse er kjernefysiske eksport av CENP-F i G2 fase, som er avhengig av Cdk110,11. Vi beskriver her en protokoll for identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder i cNLS av CENP-F. Phosphomimetic mutasjoner av disse nettstedene tregere kjernefysiske import av CENP-F, antyder at Cdk1/cyclin B direkte regulerer mobilnettet lokalisering av CENP-F ved fosforylering i sin cNLS10.
Samlet gjør denne i vitro kinase analysen identifikasjon av bestemte underlag for kinase Cdk1. Purified målet proteiner er fosforylert i vitro kommersielt tilgjengelige Cdk1/cyclin B komplekset og webområdene fosforylering identifiseres senere av massespektrometri. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder støtter mekanistisk studier som viser hvordan Cdk1 styrer cellen syklus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter og phosphorylates anslagsvis 8-13% av proteom; men er antall identifiserte mål for Cdk1, spesielt i menneskeceller fortsatt lav. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder er viktig som de gir mekanistisk innsikt i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Cellen syklus regulering er avgjørende for trofast kromosom segregering mangler i denne kompliserte prosessen fører til chromosomal avvik og kreft.
Her beskriver vi en i vitro kinase analyse som brukes til å identifisere Cdk1-spesifikke fosforylering områder. I denne analysen, en renset protein er fosforylert i vitro av kommersielt tilgjengelige menneskelige Cdk1/cyclin B. vellykket fosforylering er bekreftet av SDS side og fosforylering nettsteder identifiseres senere massespektrometri. Vi beskriver også rensing protokoller som gir svært ren og homogen protein forberedelser for kinase analysen, og en bindende analysen identifiserte fosforylering nettsteder, som sonder samspillet mellom funksjonell bekreftes et klassisk kjernefysiske lokalisering signal (cNLS) og dens kjernefysiske transport reseptoren karyopherin α. For å hjelpe med eksperimentell design, vi går gjennom metoder for prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder fra protein sekvenser. Sammen gir disse protokollene en svært kraftig metode som gir Cdk1-spesifikke fosforylering områder og aktiverer mekanistisk studier i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Siden denne metoden er avhengig av renset proteiner, kan den brukes på modellen organismen og gir pålitelig resultat, spesielt kombinert med cellen funksjonelle studier.

Vi har nylig brukt i vitro kinase analysen (figur 1) til å identifisere Cdk1-spesifikke fosforylering områder i et CENP-F-fragment som inneholdt en cNLS10. Dette signalet gir kjernefysiske lokalisering av CENP-F under mesteparten av interphase. I G2 fase eksporteres CENP-F fra kjernen til stoffer i en Cdk1-avhengige måte. For å få mekanistisk innsikt i hvordan Cdk1 regulerer mobilnettet lokalisering av CENP-F, analysert v...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er aktivert i G2 fase av cellen syklus og regulerer mange mobilnettet baner. Her presenterer vi en protokoll for i vitro kinase analysen med Cdk1, som gjør identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder for å etablere mobilnettet mål for denne viktige kinase.

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...