Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Мы благодарим д-р Дэвид Кинг, Говард Хьюз медицинский институт, Университет Калифорнии в Беркли для анализа масс-спектрометрии и полезные замечания. Мы благодарим д-р Ксуилиан Чжу, Шанхай, институты для биологических наук, Китайской академии наук, Шанхай, Китай для предоставления конструкцию полнометражные CENP-F. Наконец мы благодарим д-р Сьюзен Отрава, Брайан Калахен и д-р Кристоф Grewer в университете Бингемтон для доступа к оборудованию. Это исследование финансировалось Фондом исследований государственного университета Нью-Йорка и Кафедра химии университета в Нью-Йорк в Бингамтоне.

1. Прогнозирование фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов из последовательности белка
<ol><li>Перед началом assay киназы, анализа последовательности белка для предсказал Cdk1-конкретных сайтов фосфорилирования и поиск литературы для экспериментально установленном фосфорилирование сайтов ...

Наши в vitro киназы пробирного является очень мощный метод идентификации молекулярных целей для киназы Cdk1, который представляет собой главный контроллер клеточного цикла и регулирует многие важные клеточные процессы. Этот метод определяет, если очищенный белок является субстратом...

Киназы являются ферменты, которые регулируют многие клеточные процессы и передачи фосфатные группы от АТФ на субстраты. Этот фосфорилирование является обратимым, быстро, добавляет два отрицательными зарядами и хранит свободной энергии и является одним из наиболее распространенных Посттрансляционная изменений используется клетками. Cdk1, который также известен как гомолога белка 2 цикла деления клеток (cdc2) — это главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот1,2,3,4,5и фосфорилирует оценкам, 8-13% протеома6,7.
Хотя последние протеомических исследований выявили многие сайты фосфорилирование белков, в большинстве случаев, ответственных за эти изменения киназы неизвестна. Количество известных Cdk1 целевые показатели, особенно в клетках человека является низкий7. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных имеет важное значение, как он позволяет механистический исследования, которые устанавливают, как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла важно для верных хромосома сегрегации и деление клеток, и множество клеточных процессов должны произойти для поддержки этой важной физиологические функции. Это включает в себя прекращение транскрипции и трансляции до начала митоза, а также драматические реорганизации в клеточной структуры и организации, например разборка ядерная оболочка, конденсация хромосом и митотического шпинделя собраний. Ошибки в этих процессах и дерегулирование вызывают рак, врожденные дефекты или митотическая клеточной смерти. Специфичные ингибиторы Cdk1 как RO-3306 были развитыми8, которые обеспечивают мощные инструменты для функциональных исследований, и некоторые из этих ингибиторов в настоящее время в клинических испытаниях для лечения рака (см.9 для обзора).
Здесь мы описываем в vitro киназы assay который позволяет идентифицировать фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов. В этот assay коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B используется для фосфорилировать очищенный целевого белка в пробирке. Фосфорилирование субстрата увеличивает его массы и добавляет два негативных обвинения; Таким образом успешные фосфорилирование подтверждается сдвигу вверх группы гель белка на SDS-PAGE. Впоследствии фосфорилирование Cdk1-конкретные сайты идентифицируются по масс-спектрометрии анализа белка в vitro фосфорилированных. Для помощи с экспериментального дизайна, мы также обзор вычислительных средств и ссылки для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов из последовательности белка. Кроме того мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов подходит для assay киназы. Наконец выявленных фосфорилирование сайты должны быть проверены на функциональные исследования, и простой привязки пробирного описан здесь для этой цели. Комбинированные, это очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла7,10,11. Поскольку этот метод опирается на очищенных белков, он может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты. Однако, рекомендуется функциональной верификации полученных фосфорилирование сайтов в пробирке , поскольку клетки имеют дополнительные механизмы регулирования в месте, например Посттрансляционная модификаций, взаимодействия партнеров или клеточной локализации, может сделать фосфорилирование сайты доступными или недоступными для признания Cdk1.
Cdk1 признает консенсус фосфорилирование сайт, который состоит из (Ser/Чет-Pro-X-Lys/Arg), где X — это остатки и серина или треонин сайт фосфорилирования. Особенно важное значение для признания является наличие пролина в положении + 1. Кроме того, основные остатков предпочтительны в позиции + 2 и + 3, большинство сайтов фосфорилирование Cdk1-конкретным, содержащий Lys или Arg на + 3 позиция6,12.
Активация Cdk1 жестко регулируется и приводит к возникновению митоз1,2,3,4,5. Деятельность циклин зависимых киназ в целом зависит от их ассоциации с собственный циклинов (циклин A, B, C, D и E в организме человека), которые выражаются в колебательных уровнях на протяжении клеточного цикла13. Выражение Cdk1 является постоянным по всей клеточного цикла и регулирование своей деятельности опирается на его связь с нормативной субблоков циклин A и циклин B5,13,14,15, как Ну как столб-поступательные изменения. Формирование комплекса Cdk1/циклин B требуется для киназы активации5,14,,1516,17,18. В G2 фазе циклин B переведен в цитозоле и импортированы в ядре, где он привязывается к Cdk15,14,,1516,17,18; Однако Cdk1/циклин B проводится инактивированных фосфорилирования в остатки Thr14 и Tyr15 на человека Cdk1-тормозящий киназы Myt1 (связанный мембранами перст-тирозин треонин конкретных и cdc2-тормозящий киназы) и Wee1, соответственно19, 20,21. В конце фазы G2 дефосфорилирование Thr14 и Tyr15 путем деления клеток цикла 25 фосфатазы (cdc25) активизирует деятельность киназы Cdk1/циклин B комплекса и инициирует начало митоз12,14, 18 , 20 , 22 , 23. фосфорилирование Thr161 также необходим для активации Cdk1/циклин B и опосредовано Cdk7, Cdk активации киназы (ЦАК)18. Деградации циклин b в анафазе инактивирует Cdk1, позволяя выход из митоз24,25. Активация Cdk1/циклин B поэтому является сложным процессом. Протокола, представленные здесь выполняется с коммерчески доступных Cdk1/циклин б. В ходе рекомбинантных выражение этого комплекса в клетках насекомых это активированные в vivo эндогенного киназы14,20 и остается активным в состоянии очищенных. Итоговый активная, рекомбинантного человеческого Cdk1/циклин B подходит для в vitro киназы анализов.
Здесь мы описываем протокол для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов в человека центромер протеина F (CENP-F)10. CENP-F это Кинетохор белок, который проживает в ядре в течение большей части межфазовые изолирующие (G1 и S-фазы) и экспортируется в цитозоль в G2 фазе26,27,28 Cdk1-зависимых образом10, 11. ядерной локализации присуждается двудольных жизнь26. cNLSs распознаются α karyopherin фактор ядерного транспорта, который облегчает, вместе с karyopherin β и RanGDP, импорт жизнь грузов в ядро29. Ядерного экспорта в G2 фазе обеспечивается через путь неизвестным экспорта10. После того, как CENP-F находится в цитозоле, он нанят для того, чтобы ядерная оболочка и в свою очередь набирает30,комплекс Динеин двигательные белки31. Этот путь имеет важное значение для позиции соответствующих Центросома ядро на начальных стадиях митотического шпинделя Ассамблеи образом Динеин зависимых, который имеет важное значение для правильного времени митотическая входа и основных процессов в мозге развития30,,3132. Начиная с этапа G2, CENP-F является также смонтирован в Кинетохор где он имеет важную роль для верных хромосома сегрегации27,28,33,34,35 . Ключевым шагом регулирования этих путей является ядерным экспортом CENP-F в G2 фазе, которая зависит от Cdk110,11. Мы здесь описать протокол для идентификации Cdk1-конкретных сайтов фосфорилирования в жизнь CENP-F. Phosphomimetic перегласовок этих сайтов замедлить ядерного импорта CENP-f, предполагая, что Cdk1/циклин B непосредственно регулирует клеточной локализации CENP-F, фосфорилирование его жизнь10.
В целом этот assay в vitro киназы позволяет выявлять конкретные субстраты для киназы Cdk1. очищенные целевых белков, фосфорилированных в vitro коммерчески доступных Cdk1/циклин B комплекс и фосфорилирование сайты Впоследствии идентифицируются по масс-спектрометрии. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных поддерживает механистический исследования, которые показывают, как Cdk1 управляет клеточного цикла.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) представляет собой главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот и фосфорилирует оценкам 8-13% протеома; Однако количество выявленных целей для Cdk1, особенно в клетках человека по-прежнему низка. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных важно, как они обеспечивают механистический понимание как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла имеет решающее значение для верующих хромосома сегрегации, и дефекты в этот сложный процесс приведет к хромосомных аберраций и рака.
Здесь мы описываем в vitro киназы assay который используется для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов. В этот assay, очищенный белок является фосфорилированных в пробирке , коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B. успешный фосфорилирование подтверждается SDS-PAGE, и впоследствии фосфорилирование сайты идентифицируются по масс-спектрометрии. Мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов для assay киназы и пробирного привязки для функциональной проверки выявленных фосфорилирования сайтов, которые исследует взаимодействие между Классическая ядерной локализации сигнал (cNLS) и его перевозки ядерных рецепторов karyopherin α. Для помощи с экспериментального дизайна, мы рассматриваем подходы для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов от белковых последовательностей. Вместе эти протоколы представляют очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла. Поскольку этот метод опирается на очищенные белки, может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты, особенно в сочетании с функциональных исследований клеток.

Недавно мы использовали в vitro киназы assay (рис. 1) для выявления конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов в фрагмент CENP-F, который содержится в жизнь10. Этот сигнал наделяет ядерной локализации в течение большей части межфазных CENP-f. В фазе G2 CEN...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) активируется в G2 фазе клеточного цикла и регулирует многие сотовых пути. Здесь мы представляем протокол assay киназы в пробирке с Cdk1, который позволяет идентифицировать Cdk1-конкретных фосфорилирование сайтов для создания клеточных мишеней этой важной киназы.

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...