Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Vi tackar Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California i Berkeley för masspektrometri analys och hjälpsamma kommentarer. Vi tackar Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institut för biologiska vetenskaper, kinesiska vetenskapsakademin, Shanghai, Kina för att tillhandahålla en fullängds CENP-F-konstruktion. Slutligen, vi tackar Dr. Susan Bane, Dr Brian Callahan och Dr Christof Grewer vid Binghamton University för tillgång till utrustning. Forskningen finansierades av stiftelsen forskning för State University of New York och Institutionen för kemi, State University of New York vid Binghamton.

1. förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvens
<ol><li>Innan du börjar Kinas analysen, analysera protein sekvensen för förutsedda Cdk1-specifika fosforylering webbplatser och Sök litteraturen för experimentellt fastställda fosforylering platser med okänd kinase specificitet. Använd följande verktyg, databaser och referenser som resumeras.<ol>
<li>Använda de iGPS 3.0 programvara36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full...

Vår i vitro kinase analysen är en mycket kraftfull metod att identifiera molekylära mål för Kinas Cdk1, som är en master controller av cellcykeln och reglerar många viktiga cellulära processer. Metoden avgör om ett renat protein är ett substrat för Cdk1 och tillåter identifiering av specifika fosforylering platser. Detta underlättar mekanistiska studier för reglering av cellulära processer genom fosforylering via Cdk1.
Den mest kritiska faktorn för framgångsrik identi...

Kinaser är enzymer som transfererar fosfat från ATP på substrat och reglerar många cellulära processer. Detta fosforylering är reversibel, snabb, lägger två negativa laddningar, och lagrar fri energi och är en av de vanligaste posttranslationell ändringar används av celler. Cdk1, som också kallas cell division cycle protein 2 homolog (cdc2) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer1,2,3,4,5, och phosphorylates en uppskattningsvis 8-13% av proteomet6,7.
Medan nyare proteomiska studier har identifierat många fosforylering platser i proteiner, i de flesta fall, är tyrosinkinashämmare som är ansvarig för dessa ändringar okänd. Antalet kända Cdk1 mål, särskilt i mänskliga celler är låg7. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser är viktigt, eftersom det möjliggör mekanistiska studier som fastställer hur Cdk1 styr cellcykeln. Cellcykelns reglering är viktigt för trogna kromosomsegregering och celldelningen, och en myriad av cellulära processer måste ske för att stödja denna viktiga fysiologiska funktion. Detta inkluderar att stoppa transkription och translation före uppkomsten av Mitos, liksom en dramatisk omorganisation i cellstruktur och organisation, till exempel demontering av kärn kuvert, kromosom kondens och mitotiska spindelenhet. Avreglering och fel i dessa processer orsaka cancer, fosterskador eller mitotiska celldöd. Hämmare av Cdk1 såsom RO-3306 var utvecklade8, som ger kraftfulla verktyg för funktionella studier, och några av dessa hämmare är för närvarande i kliniska prövningar för behandling av cancer (se9 för granskning).
Här beskriver vi en in vitro- Kinas analysmetod som möjliggör identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser. I denna analys används kommersiellt tillgängliga mänskliga Cdk1/cyklin B att fosforylera en renad mål protein i vitro. Fosforylering av substrat ökar dess massa och lägger till två negativa laddningar; Därför bekräftas framgångsrika fosforylering av en uppåtvinkling protein gel bandet på SDS-PAGE. Cdk1-specifika fosforylering platser identifieras senare av masspektrometri analys av proteinet i vitro fosforyleras. För att underlätta med experimentell design, granskar vi även beräkningsverktyg och referenser för förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvens. Dessutom beskriver vi också rening protokoll som ger mycket ren och homogen protein preparat lämplig för Kinas analysen. Slutligen de identifiera fosforylering webbplatserna måste kontrolleras av funktionella studier, och en enkel bindning analys beskrivs här för ändamålet. Kombinerat, är detta en mycket kraftfull metod som ger Cdk1-specifika fosforylering platser och möjliggör mekanistiska studier i hur Cdk1 styr cellcykeln7,10,11. Eftersom denna metod förlitar sig på renade proteiner, kan det tillämpas på någon modell organismen och ger tillförlitliga resultat. Men funktionell kontroll av den erhållna fosforylering platser i vitro rekommenderas, eftersom cellerna har ytterligare reglerande mekanismer på plats, såsom posttranslationell modifieringar, interaktion partner eller cellulär lokalisering som kan göra fosforylering platser tillgängliga eller otillgängliga för erkännande av Cdk1.
Cdk1 erkänner en konsensus fosforylering webbplats som består av (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), där X är alla rester och en serin eller treonin är platsen för fosforylering. Särskilt viktigt för erkännande är förekomsten av prolin i + 1 position. Dessutom grundläggande rester är att föredra i + 2 eller + 3 positioner, med de flesta Cdk1-specifika fosforylering webbplatser som innehåller en Lys eller Arg på de + 3 position6,12.
Aktivering av Cdk1 är hårt reglerad och leder till uppkomsten av Mitos1,2,3,4,5. Aktiviteten av cyklin-beroende kinaser beror i allmänhet på deras förening med distinkta cyclins (cyklin A, B, C, D, och E hos människor), som uttrycks på svängande nivåer i hela cellcykeln13. Cdk1 uttryck är konstant över cellcykeln och regleringen av dess aktivitet är beroende av dess förening med föreskrivande subunitsna cyklin A och cyklin B5,13,14,15, som samt post-translationella modifieringar. Bildandet av Cdk1/cyklin B-komplex krävs för Kinas aktivering5,14,15,16,17,18. I den G2-fasen, är cyklin B översatt i cytosolen och importeras in i cellkärnan där det binder till Cdk15,14,15,16,17,18. dock hålls Cdk1/cyklin B inaktiverade genom fosforylering på rester Thr14 och Tyr15 av de mänskliga Cdk1-hämmande kinaser Myt1 (membran-associerade tyrosin - och treonin-specifika cdc2-hämmande kinase) och Wee1, respektive19, 20,21. I den sena G2-fasen, Defosforylering av Thr14 och Tyr15 av celldelning cykel 25 fosfatas (cdc25) aktiverar kinase aktiviteten av Cdk1/cyklin B-komplex och utlöser inledandet av Mitos12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforylering av Thr161 krävs också för Cdk1/cyklin B aktivering och medieras av Cdk7, Cdk-aktiverande kinase (CAK)18. Nedbrytning av cyklin B i Anaphasen inactivates Cdk1, så att utloppet från Mitos24,25. Aktivering av Cdk1/cyklin B är därför en komplicerad process. Det protokoll som presenteras här utförs med kommersiellt tillgängliga Cdk1/cyklin B. Under rekombinant uttryck för detta komplex i insekt celler, det är aktiverat i vivo av endogena kinaser14,20 och förblir aktiv i tillståndet renat. Den resulterande aktiv, rekombinant humant Cdk1/cyklin B är lämplig för in vitro- Kinas analyser.
Här beskriver vi ett protokoll för identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser i mänskliga centromer protein F (CENP-F)10. CENP-F är en Kinetochor protein som finns i kärnan under större delen av interphase (G1 och S-fas) och exporteras till cytosolen i G2 fas26,27,28 Cdk1-beroende sätt10, 11. cellkärnelokalisering ges av en bipartit cNLS26. cNLSs känns igen av den nukleära transporter faktor karyopherin α, vilket underlättar, tillsammans med karyopherin β och RanGDP, import av cNLS-Last till nucleus29. Kärnteknisk export i fasen G2 underlättas via en okänd export väg10. När CENP-F finns i cytosolen, det rekryteras att kärn kuvertet och i sin tur rekryterar de motoriska protein komplexa dynein30,31. Denna väg är viktigt att placera kärnan respektive till centrosome under inledningsskedet av mitotiska spindelenhet i ett dynein dosberoende sätt, vilket är viktigt för den rätta tidpunkten för mitotiska inträde och för en grundläggande process i hjärnan utveckling30,31,32. Start i den G2-fasen, monteras CENP-F också i Kinetochor där det har viktiga roller för trogna kromosom segregation27,28,33,34,35 . En viktig reglerande steg av dessa vägar är kärnteknisk export av CENP-F i den G2-fasen, som är beroende av Cdk110,11. Vi beskriver här ett protokoll för identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser i cNLS CENP-f. Phosphomimetic mutationer i dessa platser sakta ner nukleära import av CENP-F, vilket tyder på att Cdk1/cyklin B direkt reglerar cellulär lokalisering av CENP-F genom fosforylering av dess cNLS10.
Sammantaget möjliggör denna in vitro- Kinas analys identifiering av specifika substrat för Kinas Cdk1. renat mål proteinerna är fosforylerade in vitro- av kommersiellt tillgängliga Cdk1/cyklin B-komplex och fosforylering webbplatser är därefter identifierade genom masspektrometri. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser stöder mekanistiska studier som avslöjar hur Cdk1 styr cellcykeln.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer och phosphorylates uppskattningsvis 8-13% av proteomet; antalet fastställda mål för Cdk1, särskilt i mänskliga celler är dock fortfarande låg. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser är viktigt, eftersom de ger mekanistiska insikter i hur Cdk1 styr cellcykeln. Cellcykelns reglering är kritiska för trogna kromosomsegregering och defekter i denna komplicerade process leda till kromosomavvikelser och cancer.
Här beskriver vi en in vitro- Kinas analysmetod som används för att identifiera Cdk1-specifika fosforylering platser. I denna analys, är ett renat protein fosforyleras i vitro av kommersiellt tillgängliga mänskliga Cdk1/cyklin B. framgångsrika fosforylering bekräftas av SDS-PAGE, och fosforylering platser identifieras därefter med masspektrometri. Vi beskriver också rening protokoll som ger mycket ren och homogen protein preparat passar kinase analysen, och en bindande analys för funktionell kontroll av de identifiera fosforylering webbplatser, som sonder samspelet mellan en klassisk cellkärnelokalisering signal (cNLS) och dess nukleära transporter receptor karyopherin α. För att underlätta med experimentell design, granskar vi metoder för förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvenser. Tillsammans ger dessa protokoll en mycket kraftfull metod som ger Cdk1-specifika fosforylering platser och möjliggör mekanistiska studier i hur Cdk1 styr cellcykeln. Eftersom denna metod förlitar sig på renade proteiner, kan det tillämpas på modellen organism och avkastning tillförlitliga resultat, särskilt i kombination med cell funktionella studier.

Nyligen har vi använt ett test-(figur 1) in vitro- Kinas att identifiera Cdk1-specifika fosforylering platser i ett CENP-F-fragment som innehöll en cNLS10. Denna signal ger cellkärnelokalisering CENP-f under större delen av interfasen. I den G2-fasen exporteras CENP-F från kärnan till cytosolen på ett sätt som Cdk1-beroende. För att erhålla mekanistiska insikter om hur Cdk1 reglerar cellulär lokalisering av CENP-F, ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) aktiveras i den G2-fasen i cellcykeln och reglerar många cellulära vägar. Här presenterar vi ett protokoll för en in vitro- Kinas analys med Cdk1, som möjliggör identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser för fastställande av cellulära mål denna viktigt-Kinas.

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkompetitionsanalys för fosforyleringsställningsbestämning

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...