Name: enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors at JoVE.com

JMN ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (T32GM088129) ve Ulusal Enstitüsü Diş ve fasiyal araştırma (F31DE026682) mali desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri her ikisi de kabul eder. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu proje aynı zamanda NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 ve S10 RR024574) ve Joel M. Sederstrom uzman yardımı fon ile Sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Baylor Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.
1. tümör hasat ve sindirim
Not: ~ 3-5 dk hasat için gerekli zamanı geldi/tümör ve işleme için gereken süreyi ~ 1 saat + 2-3 dk/tümör.
<ol><li>Fareler tarafından karbondioksit inhalasyon ötenazi ve her fare aşağı % 70 etanol ile saç kontaminasyonu önlemek için hasat önce sprey. Cerrahi olarak subkutan tümör...

<ol>
	<li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+hallmarks+of+cancer.">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors.">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li><li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors.">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106 (2016).</li><li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer.">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8++T+cells:+changing+strategies+for+cancer+treatment.">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li><li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment:+perspectives+for+the+personalized+therapy.">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-Cytometry:+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes.">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice.">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigorous+Science:+A+How-To+Guide.">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples.">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li><li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Mass+Cytometry+(CyTOF)+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells.">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li><li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model.">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li></ol>

ZAMAN çeşitli ve karmaşık hücresel bileşenleri ve molekülleri oluşmaktadır. Son kanıtlar bu ortamda doğru karakterizasyonu daha iyi anlaşılmasını tedavi başarı veya başarısızlık sağlayabilir ve hatta tedavi direnç mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir gösteriyor. Örneğin, çeşitli immünsüpresif hücreleri (Yani, MDSCs, düzenleyici T hücreleri, vs) intratumoral düzeylerini artırma efektör bağışıklık yanıtı azaltmak ve immunotherapeutic etkileri iptal et...

Baskılayıcı zaman son zamanlarda kanser damgasını kabul edilmiştir ve gelişme, ilerleme ve solid tümör kanser koruma önemli bir rol oynar gibi onların duyarlılık immünoterapi1azaltmak bilinmektedir. ZAMAN çok sayıda hücresel alt kümeleri ve fenotipleri, tüm bunların içine tümör immünolojik durumunu kritik hakkında bilgi sağlayan oluşur. İmmünolojik şu alt kümeleri daha fazla birlikte doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı2,3çoğunluğu oluşturan hücrelere lenfosit veya miyeloid kökenli, tabakalı. İmmunotherapeutic stratejileri (Yani, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri, chimeric antijen reseptör T-hücreleri, vb) dayanıklı kanser neden potansiyeline sahip kanserli hastalarda alanındaki son gelişmeler göstermiştir regresyonlar; Ancak, bunlar solid tümör kanser4,5' te görece etkisiz kalır. Çok sayıda gruplar en kritik engel kez tedavi başarı6,7üzerinde oynayabilir ve böylece, yeni immunotherapies özellikle odaklanarak önceden klinik ortamda doğru değerlendirmek gerek kalır göstermiştir onların yetenek modüle veya saat8üstesinden gelmek için.
ZAMAN genellikle karakterize etmek için şimdiki çabalar ya mikroskobu kullanmak veya akış sitometresi ile birlikte hücresel bağışıklık alt kümeleri ve onların özellikleri9,10tanımlamak için stratejiler etiketleme antikor. Bu iki stratejileri mikroskobu kayma takdir hücresel alt kümeleri ve yüksek işlem hacmi ve hücresel değişikliklerin daha geniş miktar akış sitometresi sağlar gibi benzersiz olarak farklı bilgiler sağlamanız. Şimdi 7 parametreleri destekler, spektral görüntüleme sistemleri en iyi duruma getirme floresan multiplex immünhistokimya son gelişmeler rağmen sınırlı panel boyutu geniş düzeyde bağışıklık profil oluşturma zor yapar ve bu nedenle bu teknik kez daha fazla bilgi için saklıdır analizleri duruldu. Sonuç olarak, akış sitometresi teknikleri profil oluşturma en çok kullanılan bağışıklık biri olmaya devam etmektedir. ZAMAN karakterizasyonu rağmen yaygın kullanımı, işleme ve boyama için kullanılan yöntemleri oldukça değişkendir. En sık iletişim kurallarını kullanmak bir tümör enzim dissociating (Yani, collagenases, DNaz, vb) ve tek hücreli süspansiyonlar, elde etmek için el ile ayrılma yöntemleri takip antikor boyama ve analiz7tarafından. Her yöntemin faydaları rağmen çok sayıda gruplar bu teknikleri11indüklenen geniş değişkenlik göstermiştir. Bu tümör microenvironment profil oluşturma çapraz-çalışma karşılaştırmalar geçici son derece zor, hatta aynı fare tümör modeli değerlendirirken. Ayrıca, sınırlı potansiyel tümör hücresel değerlendirmek için bu yöntemleri sağlar ve tümör bağışıklık sızmak bileşenleri bağımsız olarak, her iki bileşenin sindirim sonra serpiştirilmiş olan bu yana. Örnek miktar sonra sınırlar paneli çoklu boyama ve analiz, nadir immünolojik alt kümeleri karakterize etmek çalışırken büyük bir sorun olur (Yani, tümör özel T-hücreleri)12. Kitle sitometresi veya sitometresi saat uçuş (CyTOF), tarafından gibi daha yeni teknikler 42 bağımsız parametreleri13den büyük masası tasarımları destekleyen bazı sistemleri ile hücresel alt kümeleri yüksek boyutlu fenotipik analizi sağlar. CyTOF teknoloji bağışıklık profil oluşturma içinde muazzam güç rağmen bu gider, analiz uzmanlık ve ekipman erişim nedeniyle sınırlı kalır. Buna ek olarak, birçok CyTOF protokolleri sinyal-gürültü oranı14geliştirmek için bağışıklık alt kümeleri arıtma tavsiye ve böylece bizim zenginleştirme yöntemi kullanılan olabilir öneririz veri kalitesini artırmak için CyTOF analiz ters yönde.
Burada bir tümör microenvironment sindirim ve tümör bağışıklık birleştirmek yöntemi sızmak ayırma Analizi açıklanmaktadır. Bu yöntemin amacı bağımsız yüksek üretilen iş tümör bağışıklık sızmak ve tümör hücresel bölümler tümör microenvironment daha geniş karakterizasyonu için profil oluşturma izin vermektir. Subkutan solid tümör manken önemli kayma immünolojik heterojenite için bulundu gibi bu yöntemi kullanarak, biz daha fazla bütün tümör çözümlemesini önemini göstermektedir. Bu tümör içinde hücresel bağışıklık alt kümeleri için zenginleştirir ve bağımsız bir tümör bağışıklık kesirler ve tümör hücre profil oluşturma için sağlar çünkü genel olarak, bu yöntem daha doğru ve tutarlı bir şekilde örnekleri arasında karşılaştırabilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">6 to 12 week old male C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:113px;">Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Mice used in our tumor studies</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td>
			<td style="width:113px;">Acquired from collaborator&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PX1840</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Murine surgical tool kit</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:167px;">Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">24-well plate&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">T1024</td>
			<td style="width:167px;">Or any 24-well flat bottom plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R0883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">234153</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:113px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">LS004189</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:113px;">BioExpress (supplier: Genemate)&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-3200-LS</td>
			<td style="width:167px;">Or any orbital shaker.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Thermoregulating incubator</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-255-27</td>
			<td style="width:167px;">Or any other thermo-regulated incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:113px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">E177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 mL Pipette and tips</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13-690-032</td>
			<td style="width:167px;">Or any other pipette and tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 um Cell Strainers</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">15 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 mL Luer-Lok Syringe without needles</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lymphoprep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:113px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7811</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">P7212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D8573</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">00-5523-00</td>
			<td style="width:167px;">Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermoregulated Centrifuge</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">For 96-well cell volumetric counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&#160;Clone 2.4G2&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">553141</td>
			<td style="width:167px;">Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34962</td>
			<td style="width:167px;">Fixable viability stain</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">47-0451-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-5961-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD8-&#945; Antibody (KT15), PE</td>
			<td style="width:113px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-53473&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0041-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">56-5321-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0114-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">48-4801-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-0112-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-5931-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46-9972-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711</td>
			<td style="width:113px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563755</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors

Tümör bağışıklık microenvironment (zaman) son zamanlarda özellikle immunotherapies için solid tümör tedavi yanıtının kritik bir aracı olarak kabul edilmiştir. Klinik gelişmeler son immünoterapi tümör ve onun ilişkili bağışıklık infiltrat doğru ve iyice ayırdetmek tekrarlanabilir yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Tümör enzimatik sindirim ve akış sitometrik çözümlemesi çok sayıda bağışıklık hücre alt kümeleri ve fenotipleri geniş karakterizasyonu izin; Ancak, derinlik analizi kez panel tasarım ve büyük tümör örnekleri elde etmek için gereken nadir bağışıklık nüfus ilgi gözlemlemek için fluorophore kısıtlamalar ile sınırlıdır. Böylece, ayıran ve tümör bağışıklık infiltrat non-immün tümör bileşenlerinden zenginleştirici bir etkili ve yüksek üretilen iş yöntem geliştirdik. Açıklanan tümör sindirim ve santrifüj yoğunluğu tabanlı ayırma tekniği tümör ve tümör ayrı karakterizasyonu bağışıklık infiltrat kesirler ve hücresel canlılığı korur ve böylece, tümörün geniş bir karakterizasyonu sağlar immünolojik durumu. Bu yöntemi daha da tutarlı bütün tümör immünolojik profil oluşturma teknikleri gerek gösteren geniş kayma bağışıklık heterojenite solid tümör olarak karakterize etmek için kullanıldı. Genel olarak, bu yöntem bir etkili ve uyarlanabilir teknik subkutan solid fare tümör immünolojik karakterizasyonu için sağlar; Bu nedenle, bu aracı tumoral immünolojik özellikleri daha iyi tanımlamak için kullanılabilir ve Roman immunotherapeutic stratejileri preklinik değerlendirilmesi.

Bizim sonuçlar non-immün tümör bileşenlerinden ayırma TIL önemli yararı iletişim kuralında açıklandığı gibi gösterilmektedir. Ayrıca, açıklanan yöntemi kullanarak biz kurulan solid tümör önemli immünolojik heterojen göstermek.
Birçok tümör ayrışma teknikleri ile önemli bir sorun en sık sert sindirim koşulları (Yani, yüksek sıcaklıklarda, yetersiz besin kaynağı, vb) bir son...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors at JoVE.com

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

The overall goal of this technique is to provide a method for simultaneous profiling of both the immune and cancer cell fractions contributing to the immune microenvironment of solid tumors. This method can help answer key questions in the immune oncology fields, such as what immune and non-immune serial changes occur within the tumor following a given treatment. The main advantage of this technique is that it facilitates the effective enrichment of tumor immune and non-immune components, allowing a thorough profiling of the tumor immunologic state.The overall goal of this method is to efficiently profile the tumor immune microenvironment and identify treatment induced changes. After spraying the mouse with 70%ethanol to prevent hair contamination, surgically remove the subcutaneous tumors, taking care that the tumors are free of any contaminating tissue. Then, place each tumor in 1.8 milliliters of base RPMI 1640 medium without fetal bovine serum in individual wells of a 24-well plate on ice.When all of the tumors have been collected, use scissors to cut the samples into less than one cubic millimeter pieces and add 200 microliters of freshly prepared 10X dissociation cocktail containing collagenase-1, collagenase-4, and DNase one to each well. After one hour at 37 degrees Celsius, in an orbital plate shaker at 60 to 100 RPM, neutralize the reaction with one milliliter of RPMI 1640 medium supplemented with 5%FBS and two millimolar EDTA, and use a modified one milliliter pipette tip to transfer each tumor slurry sample into individual 50 milliliter conical tubes topped with individual 40 micrometer strainers. Using a 10 milliliter syringe plunger, mechanically disaggregate the tumor pieces through the strainers, periodically rinsing each strainer with two milliliters of RPMI 1640 medium plus 5%FBS until the strainers are clear of tumor.When all of the tumors have been dissociated, add medium to each tube as necessary to bring all of the samples up to the same volume and pellet the cells by centrifugation. Then, use a five milliliter serological pipette to resuspend the pellets in two milliliters of FBS supplemented medium per tube. To separate the immune and tumor cell fractions, add three milliliters of density gradient medium to the bottom of one 15 milliliter conical tube per sample and slowly layer two milliliters of tumor cell suspension down the side of each tube onto each gradient.Take care to ensure that the tumor cell suspensions are mixed well before layering, that the cell suspensions are slowly pipette down the side of the tubes, and that the tubes are handled carefully to prevent mixing of the layers. Separate the cells by density gradient centrifugation and carefully collect the top medium and tumor infiltrating leukocyte layers into one new 15 milliliter tube per sample. Discard the remaining density gradient media and resuspend the tumor pellets in two milliliters of medium plus FBS per tube.Then, centrifuge all of the samples and resuspend the tumor infiltrating leukocytes in 200 microliters and the tumor cells in two milliliters of medium plus FBS per tube on ice. To plate the cells, label one 96-well U-bottom plate for each immune staining panel plus an additional plate for cell counts and aliquot the single cell suspensions into each of the staining panel plates and the calc plate. Wash the cells two times with 200 microliters of Dulbecco's PBS per sample and block the cells with 50 microliters of FC block per well for 20 minutes at four degrees Celsius.At the end of the blocking incubation, add 50 microliters of 2X concentrated extracellular targeting antibody and fixable viability stain mixture to each well for a 30 minute incubation in the dark. At the end of the staining incubation, wash the samples two times with FACS buffer and resuspend the pellets in 200 microliters of fixation and permeabilization solution overnight at four degrees Celsius, protected from light. The next day, collect the cells by centrifugation, followed by a wash with 200 microliters of permeabilization buffer per well.Label the cells with 100 microliters of intracellular antibody staining panel in permeabilization buffer for a 30 minute incubation in the dark, followed by another permeabilization buffer wash. Then, wash the cells again with FACS buffer and resuspend the samples in 300 microliters of fresh FACS buffer for their analysis by flow cytometry. Tumor digestion, as demonstrated, with or without density gradient medium enrichment, results in an approximately 70 to 90%viable whole tumor cell population as assessed by flow cytometry.Density gradient medium enrichment promotes a greater than two-fold increase in the CD45 positive tumor infiltrating leukocyte fraction, compared to non-enriched tumor digestions, as well as numerous immune cell subsets commonly observed in immune microenvironment studies. The CD45 negative tumor cell fraction can also be profiled for numerous tumor features, such as overall tumor viability or apoptosis, proliferation capacity, and the expression of various immunosuppressive markers. To determine how myeloid and lymphocyte immunologic subsets vary throughout a single solid tumor, the tumor can be divided into four equal parts in such a way that each section contains approximately equal intratumoral regions, as well as equal dermal and peritoneal facing portions.Each piece can then be digested separately and analyzed, as demonstrated, for the presence of various immune cell populations. Once mastered, this technique can be completed in four to 8 hours depending on how many samples you have. While attempting this procedure, it's important to work quickly but efficiently to preserve cell viability.Visual demonstration of this method is critical, as the dissociation and separation steps involve techniques that are difficult to learn by written text alone. Following this procedure, flow cytometry can be performed to answer additional questions about how cellular populations change within a tumor, both in terms of abundance and phenotype. After watching this video, you should have a good understanding of how to separate and analyze both the immune and non-immune components of an established subcutaneous murine tumor using the demonstrated digestion and density gradient separation techniques.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Kanser Araştırmaları

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...