Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Forskningsrådet for uafhængige forskning, teknologi og produktion, yde #4005-00029

Opsætningen af eksperimenterende har ingen etiske og juridiske restriktioner og blev gennemført i samarbejde med Roskilde Universitet. Overblik over den eksperimentelle set-up kan ses i figur 1 og mekanismerne i den optisk kamera i figur 2.
1. forberedelse
<ol><li>Udføre alle trinene i en steril laminar flow-bænk ved rengøring af bænken og alle udstyr med 70% ethanol forud for starten af forsøget.</li>
	<li>Placer den optisk ...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Betydningen af migration i undersøgelser af udvikling, sårheling, immunologi og kræft har ført til flere forskellige metoder til at studere migration. Migration kan enten være et udtryk for en udvidelse eller lukning af kløften af celler. Oftest lukning af bunden er testet, da det er lettere at dyrke celler i en éncellelag og derefter gøre en skramme end voksende celler i en bestemt form8. Vores undersøgelse viser en optimeret metode til manuel ridser, som teknikken er nem at mestre og la...

Migration er en vigtig proces, der påvirker flere fysiologiske aspekter. I sårheling letter migration re epithelization af huden. I ikke-healing sår, såsom kroniske sår, opportunistiske bakterier forårsager infektion i såret, og åbne sår er ideelle til bakterievækst og dannelse af biofilm1,2. Biofilm er en af årsagerne til udviklingen af resistente bakterier, som er en af de største trusler mod vores moderne samfund3. I sårheling, immunceller ikke kan trænge igennem biofilm. I kræft er migration af kræftceller et afgørende skridt på metastaser, som er den primære dødsårsag for patienter med solide tumorer4,5. Derfor er det afgørende at kunne studere migration.
Scratch analysen er ofte bruges til at teste celle migration, fordi det er billigt og let at udføre på vedhængende cellelinjer, såsom fibroblast, endotel, og epitelcelle linjer6,7. I dag findes flere metoder til at udføre ridser8, og forskellige materialer er blevet rapporteret til at blive brugt, herunder tandstikkere9, celle skrabere10, lasere11og elektrisk strøm12. Alle metoderne har forskellige fordele og ulemper, og metoden bør besluttes efter celle type, budget og analyse værktøj. Som et eksempel, hvis den anvendte celletype kræver belægning, manuel pres fjernelse, fx med en tandstikker eller pipette tip, vil påvirke migration inden for området, en anden metode bør anvendes. I denne undersøgelse, vil vi fokusere på manuel afskrabning.
En ulempe for manuel afskrabning er variation af størrelsen, former for ridser og ophobning af celle på kanten af bunden. Mange protokoller findes, og en meget citeret papir rådgiver øget hastighed og/eller grundig vask efter skrabe13. Derudover er flere metoder blevet brugt til at minimere spredning, da spredning af cellerne ikke kan skelnes fra migration og derfor kan give falsk-positive resultater af migration. Nogle rapporterede metoder serum sult forud for de scratch14 og mindske mængden af serum15. Ingen af disse metoder kan dog sikre, at der er ingen spredning. Derfor kan vi rapportere en forbehandling af celler med mitomycin C at sikre ægte resultater af migration. Mitomycin C er et antibiotikum, der hæmmer DNA-syntese ved at danne et kovalente bånd med DNA, som forhindrer DNA fra adskille16. Før behandling med mitomycin C og vask med PBS før ridser, viser fundne lukning af hullet den sande migration af celler (figur 1).
Karakteristisk for alle metoderne, der er behov for et system til at analysere processen med migration17. En fælles og en billig metode til at analysere fremskridt, der er at bruge en lys-felt mikroskop til at tage billeder af bunden på forud fastsatte tidspunkter, efterfulgt af en analyse af lukning af hullet i et billede software18,19. Denne metode er tidskrævende, upålidelige med hensyn til at tage billeder på samme sted og fokus, og bevægelsen fra inkubator til kamera styrker cyklusser af temperaturændringer, mens billeder er taget. Andre metoder er blevet udviklet til at opdage migration ved at måle den aktuelle flow. De aktuelle ændringer, som cellerne dække mere plads på den plade, som er læst som en forøgelse af impedans20. Ved at måle impedans, miljø i cellerne påvirkes ikke, og metoden er derfor anses for ikke-invasiv. Denne metode bygger på specialiserede plader med guld elektroder, som er dyre, men de muliggøre påvisning af mange processer, såsom overholdelse af cellulære, spredning, migration og celledød. En stor ulempe ved denne metode er, at impedans måling ikke direkte angive migration, som faktorer, såsom temperatur har en stor indvirkning på impedans. Ændringer i impedans kan være forårsaget af flere faktorer, der ikke er gennemgået af den software, gør analysen af data mere vanskeligt. Derfor kræver manglen på visualisering en konventionel lysmikroskop at kontrollere migrering.
For at overvinde mange af ulemperne af de tilgængelige teknikker, bruger vi en real-time automatiseret optisk kamera. Den optiske kamera er en detection system med en høj overførselshastighed mikroskop i en lille platform med en linse, belysning enhed og et digitalt kamera. Det har en indbygget software, som kan teste overførsel og spredning blandt andre ting. For at påvise en migration, bruges to algoritmer til at analysere væksten og migration kinetik af celler, der kaldes spredningen og den sårheling analyse, henholdsvis. Spredning analyse er baseret på en to-trins image segmentering algoritme, der anvender tekstur analyse for at registrere forskellen mellem celle-dækkede områder (vist med gult) og tom baggrund områder af avancerede histogram analyse. Sårheling analyse er baseret på en tre-trins algoritme, der registrerer den celle éncellelag, lokaliserer sår hul og bestemmer mellemrumsbredden. Disse trin er gennemført på bruger-bestemt tidspunkt-point, og data præsenteres som overdækket areal, Mellemrumsbredde og gap område. En af de store fordele ved denne maskine er, at det muliggør billeddannelse af vedhængende celler gennem væske på grund af vinklen af kamera21. Lenstakes skrå kamerabilleder, der er fremskrevet til en z-stak en enkelt z-fly generere for at sikre, at billederne er i-fokus (figur 2). z-stakke genereres ved at flette serien af billeder (f.eks. 40) taget vinkelret på såret kanten og på tværs af hele såret. Z-stakke kan indfange af dybden af cellelag samt en i-fokus flyet på tværs af såret. Desuden, serien af billeder kan sættes sammen til en video samling af billeder, med et klik på en knap.
Vi demonstrere en optimeret protokol til påvisning af migration i linjen keratinocytter celle HaCaT. Vi testede Lactoferrin og dens N-terminale peptid, Lactoferricin, fra mennesker og køer, til at analysere deres effekt på migration som disse molekyler er blevet påvist for at have mange programmer som antimikrobielle og immun modulerende molekyler22 , 23. de fire forbindelser blev sammenlignet med ubehandlet HaCaT celler og epidermal vækstfaktor (EGF) blev anvendt som positiv kontrol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Celle migration er en vigtig proces, der påvirker mange aspekter af sundhed, såsom sårheling og kræft, og det er derfor afgørende for at udvikle metoder til undersøgelse af migration. Scratch analysen har længe været den mest almindelige in vitro- metode til at teste stoffer med anti og pro migration egenskaber på grund af sin lave omkostninger og enkel procedure. En ofte rapporteret problemet med analysen er imidlertid ophobning af celler i hele kanten af bunden. Desuden, for at hente data fra analysen, billeder af forskellige engagementer skal tages over en periode på præcis samme sted at sammenligne bevægelser af migration. Forskellige analyse programmer kan bruges til at beskrive de scratch lukning, men de er arbejdskrævende, unøjagtige, og styrker cyklusser af temperaturændringer. I denne undersøgelse viser vi en optimeret metode til afprøvning migration virkning, fx med de naturligt forekommende proteiner menneskelige - og kvæg-Lactoferrin og deres N-terminale peptid Lactoferricin på linjen epitelcelle HaCaT. En afgørende optimering er at vaske og ridse i PBS, som eliminerer den førnævnte ophobning af celler langs kanten. Dette kan forklares ved fjernelse af kationer, som har vist sig at have en effekt på keratinocytter celle-celle forbindelse. For at sikre korrekt registrering af migration, blev før behandling med mitomycin C, en DNA syntese hæmmer, tilføjet til protokollen. Endelig, vi vise automatiseret optisk kameraet, hvilket eliminerer uforholdsmæssigt store temperatur cyklusser, manuel arbejdskraft med scratch lukning analyse, samtidig med at forbedre på reproducerbarhed og sikre analyse af identiske dele af scratch over tid.

HaCaT er en keratinocytter cellelinie, en af de mest udbredte celletyper i huden. Når et sår opstår, begynde hudceller at formere sig og vandrer såret seng at lukke såret (figur 3). Begge processer er derfor af største vigtighed for korrekt healing.
Den optiske kamera kan følge begge processer i realtid. For migration, systemet giver tre datasæt: cellen dækket område, Mellemrumsbredde og g...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Her beskriver vi en metode til at teste celle migration i vitro med en automatiseret optisk kamera mikroskop. Scratch analysen har været meget udbredt, hvor lukningen af bunden er fulgt for en nærmere fastsat periode. Optisk mikroskop giver mulighed for pålidelige og billige påvisning af celle migration.

Optimeret Scratch Assay for In Vitro test af celle Migration med en automatiseret optisk kamera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration og invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcelle Tube Opstilling assay for<em&gt; In Vitro</em&gt; Undersøgelse af angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Forberedelse af celleekstrakter ved kryogrinding i en automatiseret frysermølle

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatiseret produktion af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kortikale og dopaminerge neuroner med integreret Live-Cell Overvågning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...