Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek, technologie en productie, verlenen #4005-00029

De experimentele opzet geen ethische en juridische beperking en werd uitgevoerd in overleg met de Universiteit van Roskilde. Een overzicht van de experimentele opstelling kan worden gezien in Figuur 1 en de mechanismen van de optische camera in Figuur 2.
1. voorbereiding
<ol><li>Voer alle stappen in een steriele laminaire flow-bench door het reinigen van de Bank en alle apparatuur met 70% ethanol vóór de aanvang van het experiment...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Het belang van de migratie in studies van de ontwikkeling, wondgenezing, immunologie en kanker heeft geleid tot verschillende methoden om te studeren van migratie. Migratie kan een expressie van de uitbreiding of de sluiting van de kloof door de cellen. Meestal de sluiting van de kras wordt getest, zoals het is makkelijker om te groeien van cellen in een enkelgelaagde en breng een kras dan groeit de cellen in een specifiek formulier8. Onze studie toont een geoptimaliseerde methode voor handmatige ...

Migratie is een belangrijk proces die invloeden van verschillende fysiologische aspecten. In de wondgenezing vergemakkelijkt de migratie opnieuw epithelization van de huid. In niet-genezende wonden, zoals chronische wonden, opportunistische bacteriën veroorzaken infectie van de wond en open wonden zijn ideaal voor bacteriën groei en vorming van biofilms1,2. Biofilm is een van de oorzaken van de ontwikkeling van resistente bacteriën, één van de grootste bedreigingen voor onze moderne samenleving-3. In de wondgenezing, kunnen niet de immuuncellen de biofilm doordringen. Bij kanker is migratie van de kankercellen een cruciale stap van metastase, die de belangrijkste doodsoorzaak voor patiënten met stevige tumors4,5. Het is daarom van cruciaal belang om de studie van de migratie te kunnen.
De kras bepaling wordt vaak gebruikt voor het testen van cel migratie, want het is goedkoop en gemakkelijk uit te voeren op aanhangend cellijnen, zoals fibroblast, endotheel, en6,7van de lijnen van de epitheliale cellen. Vandaag, er bestaan verschillende methoden voor het uitvoeren van krassen8, en verschillende materialen hebben gemeld moet worden gebruikt, met inbegrip van tandenstokers9, cel schrapers10, lasers11en12van de elektrische stromen. Alle methodes hebben verschillende voor- en nadelen, en de methode moet worden vastgesteld volgens de cel type, begroting en analyse tool. Als voorbeeld, als het gebruikte celtype vereist coating, manuele druk verwijdering, bijvoorbeeld met een tandenstoker of pipette uiteinde, invloed zal hebben op migratie binnen het gebied, een andere methode moet worden gebruikt. In deze studie zullen we ons richten op handmatige schrapen.
Een nadeel voor handmatige schrapen is de variatie van de grootte, vormen van de krassen en accumulatie van cel aan de randen van de kras. Er zijn veel protocollen, en een zeer geciteerde papier adviseert verhoogde snelheid en/of grondig wassen na het krassen van13. Bovendien hebben verschillende methoden zijn gebruikt om te minimaliseren van proliferatie, aangezien de proliferatie van de cellen kan niet onderscheiden van migratie worden en daarom vals-positieve resultaten van de migratie geven kan. Sommige meldden methoden zijn serum honger voorafgaand aan de kras14 en daalt de hoeveelheid serum15. Geen van deze methoden kan er echter voor zorgen dat er geen wildgroei is. Daarom, rapporteren we een voorbehandeling van de cellen met mitomycine C om echte resultaten van de migratie. Mitomycine C is een antibioticum dat remt de synthese van DNA door de vorming van een covalente binding met het DNA, die verhindert dat het DNA scheiden van16. Door vooraf te behandelen met mitomycine C en wassen met PBS voor krassen, toont de gedetecteerde sluiting van de kloof de echte migratie van de cellen (Figuur 1).
Een kenmerk van alle methoden is de noodzaak van een systeem voor het analyseren van het proces van migratie17. Een gemeenschappelijk en een goedkope methode voor het analyseren van de vooruitgang is het gebruik van een licht-veld microscoop om beelden te nemen van de kras op vooraf bepaalde tijdstippen, gevolgd door een analyse van de sluiting van de kloof in een afbeelding software18,19. Deze methode is tijdrovend, onbetrouwbaar met betrekking tot het nemen van foto's op de zelfde plek en de focus, en de beweging van incubator naar camera dwingt cycli van temperatuurveranderingen terwijl foto's zijn genomen. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren van migratie door het meten van de stroom. De huidige veranderingen, cellen bestrijken meer ruimte op de plaat, die wordt gelezen als een verhoging van de impedantie-20. De omgeving van de cellen wordt niet beïnvloed door het meten van impedantie, en de methode wordt daarom beschouwd als niet-invasieve. Deze methode berust op gespecialiseerde platen met gouden elektroden, die duur zijn, maar ze inschakelen detectie van vele processen, zoals de naleving van de cellulaire, proliferatie, migratie en celdood. Een groot nadeel van deze methode is dat de impedantie-meting geeft niet direct aan migratie, aangezien factoren zoals temperatuur een grote impact op de impedantie hebben. Wijzigingen in de impedantie kunnen worden veroorzaakt door verschillende factoren die niet worden beoordeeld door de software, de analyse van de gegevens moeilijker te maken. Het ontbreken van visualisatie vereist daarom een conventionele lichte Microscoop om te controleren of de migratie.
Om te overwinnen veel van de nadelen van de beschikbare technieken, we gebruiken een real-time automatische optische camera. De optische camera is een detectiesysteem met een hoge gegevensdoorvoer Microscoop in een klein platform met een lens, verlichting unit en een digitale camera. Het heeft een ingebouwde software, die migratie en proliferatie o.a. kunt testen. U wilt opsporen migratie, worden twee algoritmen gebruikt om de groei en de kinetiek van de migratie van de cellen, die de verspreiding en de wond genezing analyse, respectievelijk heten te analyseren. De proliferatie analyse is gebaseerd op een in twee stappen afbeelding segmentatie algoritme dat textuur analyse om te detecteren het verschil tussen cel bedekte gebieden (getoond in het geel) van toepassing is en lege achtergrond gebieden door geavanceerde histogram analyse. De wond genezing analyse is gebaseerd op een drie-stappen-algoritme dat de cel enkelgelaagde detecteert, zoekt de kloof van de wond en bepaalt de breedte van de tussenruimte. Deze stappen zijn uitgevoerd op gebruiker-bepaald tijd-punten, en de gegevens worden gepresenteerd als overdekte ruimte, Breedte tussenruimte en gap omgeving. Een van de grote voordelen van deze machine is dat hierdoor beeldvorming van Adherente cellen door vloeistof vanwege de hoek van de camera-21. De camera lenstakes bewogen beelden die worden geprojecteerd naar een z-stack van een enkel z-vliegtuig genereren om ervoor te zorgen dat de foto's in-focus (Figuur 2 zijn). z-stacks worden gegenereerd door het samenvoegen van de reeks van foto's (bijvoorbeeld 40) genomen loodrecht naar de rand van de wond, en over de gehele wond. De z-stacks kunt vastleggen van de diepte van de cellaag evenals een vliegtuig in-focus over de wond. Bovendien kan de reeks beelden samen worden gebracht aan een video-collectie van de beelden, met de klik van een knoop.
We tonen een geoptimaliseerde protocol voor de detectie van de migratie in de Keratinocyt cellijn HaCaT. We testten lactoferrine en de N-terminale peptide, Lactoferricin, van mens en koeien, voor het analyseren van hun effect op de migratie, zoals deze moleculen hebben aangetoond dat tal van toepassingen als antimicrobiële en immune modulerende moleculen22 , 23. de vier stoffen werden vergeleken met onbehandelde HaCaT cellen en epidermale groeifactor (EGF) werd gebruikt als positieve controle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Cel migratie is een belangrijk proces invloed op vele aspecten van de gezondheid, zoals wondgenezing en kanker, en het is dus cruciaal voor de ontwikkeling van methoden om te bestuderen van de migratie. De kras assay is al lang de meest voorkomende in vitro methode voor het testen van verbindingen met de eigenschappen van de anti - en pro - migration vanwege zijn lage kosten en eenvoudige procedure. Een vaak gemeld probleem van de test is echter de accumulatie van cellen over de rand van de kras. Bovendien, om gegevens te verkrijgen van de bepaling, beelden van verschillende belichtingen moeten worden genomen over een periode van tijd op exact dezelfde plek om te vergelijken van de bewegingen van de migratie. Analyse van de verschillende programma's kunnen worden gebruikt voor het beschrijven van de kras sluiting, maar ze zijn arbeidsintensief, onjuist, en krachten cycli van temperatuurveranderingen. Wij tonen in deze studie, een geoptimaliseerde methode voor het testen van het migratie-effect, bijvoorbeeld met de natuurlijk voorkomende eiwitten mens - en runderen-lactoferrine en hun N-terminale peptide Lactoferricin op de epitheliale cellijn HaCaT. Een cruciale optimalisatie is te wassen en kras in PBS, die de bovengenoemde accumulatie van cellen langs de rand elimineert. Dit kan worden verklaard door de verwijdering van kationen, waarvan is gebleken dat een effect op Keratinocyt cel verbinding. Om te zorgen voor echte detectie van migratie, werd vooraf behandelen met mitomycine C, een DNA-synthese-inhibitor, toegevoegd aan het protocol. Tot slot tonen wij de geautomatiseerde optische camera, die elimineert buitensporige temperatuur cycli, handenarbeid met kras sluiting analyse, terwijl de verbetering op de reproduceerbaarheid en het waarborgen van de analyse van identieke secties van de kras na verloop van tijd.

HaCaT is een Keratinocyt cellijn, een van de meest voorkomende soorten van de cellen in de huid. Wanneer een wond optreedt, wordt de huidcellen beginnen te vermenigvuldigen en migreer over aan het bed van de wond te sluiten van de wond (Figuur 3). Beide processen zijn daarom van het grootste belang voor een goede genezing.
De optische camera kunt beide processen in real-time volgen. Voor migratie, h...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatische Optical Heartbeat Analyse van kleine hart

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Een In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro cel-migratie en invasie assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Voorbereiding van celextracten door Cryogrinding in een geautomatiseerde vriesmolen

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...