Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
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Danish Council für unabhängige Forschung, Technologie und Produktion, gewähren #4005-00029

Der Versuchsaufbau hat keine ethischen und rechtlichen Beschränkung und in Absprache mit Roskilde University durchgeführt wurde. Ein Überblick über die Versuchsanordnung ist in Abbildung 1 und die Mechanismen der optischen Kamera in Abbildung 2ersichtlich.
1. Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Bank durch die Reinigung der Bank und alle Geräte mit 70 % Ethanol vor Beginn des Experiments...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Die Bedeutung der Migration in den Studien von Entwicklung, Wundheilung, Immunologie und Krebs führte verschiedene Methoden zur Migration zu studieren. Migration kann ein Ausdruck für die Erweiterung oder die Schließung der Lücke durch die Zellen. In den meisten Fällen die Schließung des Kratzers wird getestet, da es einfacher zu wachsen Zellen in einem monomolekularen Film und machen dann einen Kratzer als wachsen die Zellen in einem bestimmten Formular8. Unsere Studie zeigt eine optimierte...

Migration ist ein wichtiger Prozess, der verschiedene physiologische Aspekte beeinflusst. Bei der Wundheilung erleichtert Migration Re Epithelisierung der Haut. Bei nicht heilenden Wunden, z. B. chronische Wunden opportunistische Bakterien verursachen Infektion der Wunde und offene Wunden sind ideal für Bakterienwachstum und die Bildung von Biofilm1,2. Biofilm ist eine der Ursachen für die Entwicklung von resistenten Bakterien, das ist einer der größten Gefahren für unsere moderne Gesellschaft3. Bei der Wundheilung durchdringen nicht die Immunzellen den Biofilm. Im Krebs ist Migration der Krebszellen ein entscheidender Schritt der Metastasierung, die die primäre Todesursache bei Patienten mit soliden Tumoren4,5. Daher ist es entscheidend, die Migration zu studieren zu können.
Der Scratch-Test wird häufig verwendet, um Zellwanderung zu testen, weil es billig und einfach durchzuführen auf adhärenten Zelllinien, wie Fibroblasten, Endothelzellen, und Epithelzelle Linien6,7. Heute gibt es mehrere Methoden für die Durchführung von Kratzer8, und verschiedene Materialien gemeldet wurden verwendet werden, einschließlich Zahnstocher9, Zelle Schaber10, Laser11und elektrische Ströme12. Alle Methoden haben verschiedene vor- und Nachteile, und die Methode sollte nach der Zelle Art, Budget und Analyse-Tool entschieden werden. Als Beispiel wenn die verwendeten Zellentyp erfordert Beschichtung, manuellem Druck entfernen, z.B. mit einem Zahnstocher oder einer Pipette Spitze wird beeinflussen Migration im Bereich, sollte eine andere Methode verwendet werden. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die manuelle Schaben.
Ein Nachteil für manuelle Schaben ist die Variation der Größe, Formen der Kratzer und Anhäufung von Zellen an den Rändern des Kratzers. Viele Protokolle sind vorhanden, und zitierte Papier berät, erhöhte Geschwindigkeit und/oder gründliches waschen nach kratzen13. Darüber hinaus wurden verschiedene Methoden zur Verbreitung, zu minimieren, da die Proliferation der Zellen nicht unterschieden von der Migration werden und daher falsch-Positive Ergebnisse der Migration geben kann. Einige berichtet, dass Methoden Serum Hunger vor der Scratch14 und Verringerung der Menge an Serum15sind. Jedoch kann keines dieser Verfahren sicherstellen, dass es keine Verbreitung gibt. Daher melden wir eine Vorbehandlung der Zellen mit Mitomycin C um echte Ergebnisse der Migration zu gewährleisten. Mitomycin C ist ein Antibiotikum, das hemmt die DNA-Synthese durch die Bildung einer kovalente Bindung mit der DNA, die verhindert, dass die DNA trennen16. Durch die Vorbehandlung mit Mitomycin C und Waschen mit PBS vor Verkratzen, zeigt die erkannten Schließung der Lücke die wahre Wanderung von Zellen (Abbildung 1).
Ein Merkmal aller Methoden ist die Notwendigkeit eines Systems zur Analyse des Prozesses der Migration17. Eine gemeinsame und eine kostengünstige Methode, um den Fortschritt zu analysieren ist ein Lichtfeld Mikroskop verwenden, um Bilder von Grund auf zu vorher festgelegten Zeitpunkten, gefolgt von einer Analyse der Schließung der Lücke in einem Bild Software18,19. Diese Methode ist zeitaufwendig, unzuverlässig in Bezug auf die Aufnahme von Bildern an der gleichen Stelle und Fokus, und die Bewegung von Inkubator Kamera zwingt Zyklen von Temperaturänderungen während Bilder aufgenommen wurden. Andere Methoden wurden entwickelt, um Migration zu erkennen, durch die Messung des Stromflusses. Die aktuellen Änderungen, decken als Zellen mehr Platz auf der Platte, die als eine Zunahme der Impedanz20gelesen wird. Durch Messung der Impedanz, die Umgebung der Zellen ist nicht betroffen, und die Methode wird daher als nicht-invasive. Diese Methode beruht auf spezielle Platten mit gold-Elektroden, die teuer sind, aber sie ermöglichen Erkennung vieler Prozesse, wie zelluläre festhalten, Proliferation, Migration und Zelltod. Ein großer Nachteil dieser Methode ist, dass die Impedanzmessung nicht direkt, Migration anzeigt, da Faktoren wie Temperatur einen großen Einfluss auf die Impedanz haben. Änderungen in der Impedanz können durch verschiedene Faktoren verursacht werden, die nicht von der Software, erschwert die Analyse der Daten überprüft werden. Daher erfordert das Fehlen der Visualisierung einer herkömmlichen Lichtmikroskop, Migration zu überprüfen.
Um viele der Nachteile der verfügbaren Techniken zu überwinden, verwenden wir eine Echtzeit-automatisierte optische Kamera. Die optische Kamera ist ein System zur Erkennung mit einem Hochdurchsatz-Mikroskop in eine kleine Plattform mit einem Objektiv, Beleuchtung und eine Digitalkamera. Es verfügt über eine integrierte Software, die Migration und Proliferation unter anderem testen können. Um Migration zu erkennen, dienen zwei Algorithmen zur Analyse, das Wachstum und die Migration Kinetik der Zellen, die die Verbreitung und die Wundheilung Analyse, bzw. genannt werden. Die Verbreitung Analyse ist basiert auf einem zweistufigen Bild Segmentierungsalgorithmus, die Texturanalyse um den Unterschied zwischen Zelle bedeckten Bereichen (gezeigt im gelb) zu entdecken gilt und leeren Hintergrund Bereiche durch erweiterte Histogramm-Analyse. Die Wundheilung Analyse basiert auf einem drei-Stufen-Algorithmus, erkennt die Zelle Monolage, sucht die Wunde Lücke, und bestimmt die Breite der Lücke. Diese Schritte werden an Benutzer festgelegten Zeitpunkten durchgeführt und die Daten werden als überdachte Fläche, Spaltbreite und Spaltbereich präsentiert. Einer der großen Vorteile dieser Maschine ist, dass es wegen des Winkels der Kamera21Bildgebung von adhärenten Zellen durch Flüssigkeit ermöglicht. Die Bilder der Kamera-Lenstakes geneigt, die zu einem Z-Stapel von einer Z-Ebene projiziert werden zu generieren um sicherzustellen, dass die Bilder im Fokus (Abbildung 2). Z-Stapel entstehen durch die Zusammenlegung der Serie von Aufnahmen (z.B. 40) senkrecht an den Rand der Wunde, und über die gesamte Wunde. Die Z-Stapel ermöglicht die Erfassung der Tiefe der Zellschicht sowie eine Fokusebene über die Wunde. Darüber hinaus kann die Serie von Bildern auf eine video-Sammlung von Bildern, mit einem Knopfdruck zusammengestellt werden.
Wir zeigen ein optimiertes Protokoll zur Erkennung der Migration in den Keratinozyten-Zell-Linie HaCaT. Wir testeten Lactoferrin und seine N-terminale Peptide, Lactoferricin, von Menschen und Kühen, um ihre Auswirkungen auf die Migration zu analysieren, wie diese Moleküle nachgewiesen wurden, zahlreiche Anwendungen als antimikrobiell und das Immunsystem modulieren Moleküle22 haben , 23. die vier Verbindungen waren im Vergleich zu unbehandelten HaCaT-Zellen und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) wurde als Positivkontrolle verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Zellmigration ist ein wichtiger Prozess, der viele Aspekte der Gesundheit, wie Wundheilung und Krebs beeinflusst und es ist daher entscheidend für die Entwicklung von Methoden, um die Migration zu studieren. Der Scratch-Test ist seit langem die am häufigsten in-vitro- Methode, Verbindungen mit Anti - pro ungs Eigenschaften wegen seiner niedrigen Kosten und einfache Verfahren zu testen. Allerdings ist ein oft berichtete Problem des Assays die Anhäufung von Zellen über den Rand des Kratzers. Darüber hinaus müssen zum Abrufen von Daten aus der Assay Bilder von unterschiedlichen Belichtungen über einen bestimmten Zeitraum hinweg auf der exakt gleichen Stelle getroffen werden, die Bewegungen der Migration zu vergleichen. Unterschiedliche Analyseprogramme können verwendet werden, um die Kratzer Schließung zu beschreiben, aber sie sind arbeitsintensiv, ungenau, und Kräfte Zyklen von Temperaturänderungen. In der vorliegenden Studie zeigen wir eine optimierte Methode zum Testen der Migration-Effekt, z. B. mit den natürlich vorkommenden Proteinen Mensch und Rind-Lactoferrin und ihre N-terminalen Peptids Lactoferricin auf die epithelialen Zellinie HaCaT. Eine wesentliche Optimierung ist zu waschen und kratzen mit PBS-Puffer, die die oben genannten Anhäufung von Zellen entlang der Kante beseitigt. Dies könnte durch die Entfernung von Kationen, erklärt werden, die erwiesenermaßen auf Keratinozyten-Zell-Zell-Verbindung auswirken. Um wahre Erkennung von Migration zu gewährleisten, wurde Vorbehandeln mit Mitomycin C, ein DNA-Synthese-Hemmer, das Protokoll hinzugefügt. Schließlich zeigen wir die automatisierte optische Kamera, die übermäßige Temperaturzyklen beseitigt Handarbeit mit Scratch Verschluss Analyse, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und sorgt für Analyse der identische Abschnitte des Kratzers im Laufe der Zeit.

HaCaT ist eine Keratinozyten-Zell-Linie, einer der am häufigsten vorkommenden Zelltypen in der Haut. Tritt eine Wunde, beginnen die Hautzellen vermehren sich und Wandern über in das Wundbett, schließen Sie die Wunde (Abbildung 3). Beide Prozesse sind daher von größter Bedeutung für die ordnungsgemäße Heilung.
Die optische Kamera kann beide Prozesse in Echtzeit verfolgen. Für die Migration, ...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.

Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Forschung

Biologie

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Herstellung von Zellextrakten durch Cryogrinding in einer automatisierten Gefriermühle

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...