Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
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独立した研究・技術・生産、デンマーク議会許可 #4005-00029

実験のセットアップは倫理的、法的制限を持たず、ロスキレ大学との合意を行った。実験のセットアップの概要については、図 1と図 2の光学カメラの機構の見ることができます。
1. 準備
<ol><li>ベンチ ・実験の開始前に 70% のエタノールとすべての設備をクリーニングして滅菌の層流ベンチですべての手順を実行します。</li>...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. 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E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

開発、創傷治癒、免疫学、癌研究の移行の重要性は移行を検討するいくつかの異なる方法をもたらした。移行は、展開の式またはセルによるギャップの閉鎖することができます。ほとんどの場合傷の閉鎖はテスト細胞単層を成長し、特定のフォーム8細胞を成長させるよりもスクラッチに簡単です。我々 の研究は、テクニックはマスターに簡単・低コスト マニュアル掻くた?...

移行は、いくつかの生理学的な側面に影響を与える重要なプロセスです。創傷治癒の移行は皮膚の再上皮の再生を促進します。慢性の傷などのヒーリング以外の傷で日和見細菌が傷口の感染症を引き起こすし、傷口が細菌の成長とバイオ1,2の形成に最適です。バイオ フィルムは、私たちの現代社会3に対する最大の脅威の一つである抵抗力がある細菌の開発の原因の一つです。創傷治癒の免疫細胞は、バイオ フィルムを突き通すことができません。癌、癌細胞の移行は固形腫瘍4,5患者の死亡の主な原因である転移の要となる一歩です。したがって、移行を検討することができることが重要です。
スクラッチの試金はそれは安価で簡単に線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞ライン6,7などの付着性のセルラインに実行できますので、細胞遊走をテストによく使用されます。今日、傷8を実行するためにいくつかの方法が存在して、さまざまな材料が使用される報告されている、つまようじ9、セル スクレーパー10、レーザー11、電流12など。異なる長所と短所があるすべてのメソッドと、メソッドは、細胞の種類、予算、および分析ツールによって決められるべきです。例として使用されているセル型コーティング, 手動圧力除去が必要な場合例えばつまようじまたはピペットの先端と地域内での移行に影響を与える、異なるメソッドを使用してください。本研究では手動さげ仕上に焦点を当てます。
手動削りの欠点は、サイズのバリエーション、傷の形状と傷の端のセルの蓄積です。多くのプロトコルが存在して被引用論文アドバイス増加速度や13をスクラッチした後徹底的に洗浄します。さらに、いくつかの方法は、細胞の増殖が移行から識別することはできません、したがって移行の偽陽性の結果を与える可能性がありますので、増殖を最小限に抑えるために使用されています。いくつか報告方法、血清飢餓スクラッチ14の前と血清15の量を減少させます。但し、どちらの方法は、増殖がないことを保障できます。したがって、移行の真の結果を得るためにマイトマイシン C の細胞の前処理を報告します。マイトマイシン C は、DNA が16を分離することを防ぐ DNA と共有結合を形成することにより DNA 合成を阻害する抗生物質です。マイトマイシン C の前処理してスクラッチ前に PBS で洗浄するには、ギャップの検出された閉鎖は細胞 (図 1) の真の移動を示します。
すべてのメソッドの特徴は、移行17のプロセスを分析するシステムの必要性です。共通して、進捗状況を分析するための安価な方法イメージ ソフトウェア18,19のギャップの閉鎖の分析に続いて、事前に決められた時点で傷の画像を撮影するライト フィールド顕微鏡を使用することです。このメソッドは、時間のかかる、フォーカス、同じ場所で写真を撮ることに関して信頼できないと撮影しながら温度変化のサイクルを強制的にインキュベーターからカメラへの動き。他の方法は、電流の流れを測定することによって移行を検出するために開発されています。現在の変更セルとしてインピー ダンス20の増加として読み込まれる皿の上のより多くのスペースをカバーします。インピー ダンスを測定することにより、細胞の環境に影響がないとメソッドを非侵襲的な考えです。この方法は高価である金電極を用いた特殊なプレートに頼るが、彼らは細胞の付着、増殖、移行、および細胞死などの多くのプロセスの検出を有効にします。この方法の大きな欠点は、温度などの要因が大きな影響を与えるインピー ダンス インピー ダンス測定が直接移行を示されていないことです。データの解析をより難しくして、ソフトウェアによって見直されないいくつかの要因によってインピー ダンスの変化が起こります。したがって、可視化の欠如には、移行を検証する従来の光学顕微鏡が必要です。
利用可能な技術の欠点の多くを克服するためには、リアルタイム自動光学カメラを使用してください。光学カメラ、レンズ、照明ユニット、デジタル カメラと小さなプラットフォームで高スループットの顕微鏡による検出システムです。それが移行および他のものの間で拡散をテストすることができます内蔵のソフトウェアです。移行を検出するには、2 つのアルゴリズムを使用して、成長と細胞増殖および治癒解析、それぞれと呼ばれる移行動態を分析します。増殖解析は細胞に覆われた部分 (黄色で表示) の差を検出するためのテクスチャ解析を適用する 2 段階画像セグメンテーション アルゴリズムに基づいて、空高度なヒストグラム解析による背景のエリア。創傷治癒の分析は、単層細胞を検出し、特定して傷ギャップ ギャップの幅を決定する 3 つのステップ アルゴリズムに基づいています。ユーザーが決定した時点で、次の手順を実施し、カバーエリア、ギャップ幅、およびギャップ領域としてデータを表示します。この機械の大きな利点の 1 つはカメラ21の角度のため液体を付着細胞のイメージングが可能です。確実にフォーカス (図 2)、画像に生成が単一の z 平面の z スタックに予測されているカメラ傾斜 lenstakes イメージです。z スタックは、全体の傷の傷の端に垂直撮影 (例えば40) の写真のシリーズをマージすることによって生成されます。Z スタックは、フォーカスの面と同様、細胞層の深さの傷全体をキャプチャできます。さらに、一連の画像はボタンをクリックすると、画像のビデオ コレクションにまとめることができます。
ケラチノ サイト細胞株 HaCaT 移行の検出のための最適化されたプロトコルを示す.ラクトフェリンとその N 末端ペプチド、同様、人間と牛、抗菌、免疫変調分子22として多数のアプリケーションを持っているこれらの分子が実証されている、移行に及ぼす影響を分析する実験を行った,23します。 4 つの化合物を比較した未処理細胞と上皮成長因子 (EGF) が肯定的な制御として使用されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

細胞遊走創傷治癒や、がんなどの健康の多くの側面に影響する重要なプロセスであり、したがって、移行を研究する手法を開発するため非常に重要。スクラッチのアッセイは、その低コストと簡単な手順のため反プロ移行のプロパティを持つ化合物をテストする最も一般的な体外メソッドをずっと。ただし、アッセイのしばしば報告されている問題は傷の端の間で細胞の積み重ねであります。さらに、測定からデータを取得する異なる露出の画像取られなければならない期間にわたって同じ場所で移行の動きを比較します。傷の閉鎖を説明する別の解析プログラムを使用ことができますが、彼らは、労働集約的、不正確なと温度変化の力サイクル。本研究では、テスト移行効果、例えば人間と牛ラクトフェリンの天然の蛋白質およびその N 末端ペプチド ラクトフェリシン上皮細胞線 HaCaT 最適化手法を示す.重要な最適化は、洗浄し、エッジに沿って細胞の前述の蓄積を排除、PBS のスクラッチです。これは、ケラチノ サイトの細胞間の接続に影響を及ぼすことが示されている陽イオンの除去によって説明できます。移行の true 検出するように、マイトマイシン C、DNA 合成阻害剤の前処理は、プロトコルに追加されました。最後に、再現性を向上し、時間をかけて傷の同一断面の解析しながら自動光学カメラ、過度の温度サイクルを排除するスクラッチ閉鎖分析で、肉体労働を示します。

HaCaT はケラチノ サイト細胞ライン、皮膚の最も豊富なセル型の 1 つです。傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し、傷のベッド (図 3) 傷を閉じるために移行を開始します。両方のプロセスは、したがって、適切な治療のため非常に重要です。
光学カメラは、リアルタイムでの両方のプロセスに従うこと?...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

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An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

自動冷凍工場におけるクライオグラインによる細胞抽出物の調製

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

ヒト人工多能性幹細胞由来皮質およびドーパミン作動性ニューロンの統合されたライブ細胞モニタリングによる自動生産

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...