Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Датский Совет независимых исследований, технологии и производства, Грант #4005-00029

Экспериментальной установки не имеет этических и правовых ограничений и было проведено по согласованию с университет Роскилле. Обзор экспериментальной установки можно увидеть на рисунке 1 и механизмами оптической камеры на рисунке 2.
1. По...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

О важности миграции в исследованиях развития, заживление ран, иммунологии и рака привело к несколько различных методов для изучения миграции. Миграция может быть выражением расширения или закрытия разрыва клетками. Чаще всего закрытие нуля проверяется, как это легче расти клеток в мон...

Миграция является важным процессом, который влияет на некоторые физиологические аспекты. В заживлении ран, миграции облегчает повторное эпителизации кожи. В незаживающие раны, таких как хронические раны оппортунистических бактерии вызывают инфекции раны, и открытые раны идеальны для роста бактерий и образование биопленки1,2. Биопленки является одной из причин развития резистентных бактерий, который является одним из самых серьезных угроз для нашего современного общества3. В заживлении ран, иммунные клетки не могут проникнуть биопленки. В рак миграция раковых клеток является ключевой шаг метастазов, который является основной причиной смерти больных с солидными опухолями4,5. Таким образом важно иметь возможность изучения миграции.
Царапинам assay часто используется для тестирования миграции клеток, потому что это дешево и легко выполнять на линиях адэрентных клеток, фибробластов, эндотелия сосудов, и эпителиальных клеток линии6,7. Сегодня существует несколько методов для выполнения царапин8, и различные материалы были зарегистрированы для использования, включая зубочистки9, клетки скребки10, лазеры11и электрические токи12. Все методы имеют различные плюсы и минусы, и метод должно быть принято в соответствии с ячейки типа, бюджета и анализа инструмент. Например если тип используемой ячейки требует покрытия, удаление ручного давления, например с концом toothpick или пипетки, будет влиять на миграцию в пределах области, следует использовать другой метод. В этом исследовании мы сосредоточимся на ручное выскабливание.
Для ручной соскоб оборотная изменения размера, формы царапины и накопления клеток на краях нуля. Многие протоколы существуют, и высоко цитируется документ советует увеличена скорость и/или тщательного мытья после царапин13. Кроме того некоторые методы были использованы для сведения к минимуму распространения, поскольку распространение клетки не могут быть отделены от миграции и поэтому может дать ложно положительных результатов миграции. Некоторые сообщили, что методы являются сыворотки голода предшествующего нуля14 и уменьшается количество сыворотки15. Однако ни один из этих методов можно обеспечить, что нет никакого распространения. Таким образом мы приводим предварительной обработки клеток с митомицин C обеспечить реальные результаты миграции. Митомицин C — антибиотик, который подавляет синтез ДНК, формируя ковалентной связи с ДНК, которая предотвращает разделение16ДНК. Путем предварительной обработки с митомицин C и мойки с PBS до царапин, обнаруженных закрытия разрыва демонстрирует истинный миграции клеток (рис. 1).
Характерной особенностью всех методов является необходимость создания системы для анализа процесса миграции17. Общей и недорогой метод для анализа прогресса заключается в использовании микроскопом свет поле принять изображения нуля в предопределенное время точках, следуют анализ закрытия разрыва в образ программного обеспечения18,19. Этот метод является длительным, ненадежные отношении фотографировать на том же месте и фокус, и движение от инкубатора для камеры сил циклы изменения температуры во время съемки. Были разработаны другие методы для обнаружения миграции путем измерения тока. Текущие изменения, как клетки охватывают больше места на табличке, который читается как увеличение импеданса20. Путем измерения импеданса, средой клеток не влияет, и поэтому считается неинвазивный метод. Этот метод полагается на специализированных пластины с золотых электродов, которые являются дорогими, но они включить обнаружение многих процессов, таких как сотовый присоединению, распространения, миграции и гибели клеток. Большим недостатком этого метода является измерение импеданса не указывать непосредственно миграции, поскольку такие факторы, как температура имеют большое влияние на сопротивление. Изменения в сопротивление может быть вызвана несколько факторов, которые не проверены программного обеспечения, затрудняет анализ данных. Таким образом отсутствие визуализация требует обычных световой микроскоп для проверки миграции.
Чтобы преодолеть многие из недостатков имеющихся методов, мы используем реального времени автоматизированных оптической камеры. Оптическая камера является системой обнаружения с микроскопом высокой пропускной способности в небольшой платформе с объективом, блок подсветки и цифровой фотоаппарат. Она имеет встроенный программного обеспечения, которое можно проверить, миграции и распространения среди других вещей. Чтобы обнаружить миграции, два алгоритмы используются для анализа роста и кинетика миграции клеток, которые называются распространения и ранозаживляющее анализа, соответственно. Анализ распространения основе алгоритма сегментации изображения двухэтапный, которая применяет текстуру анализ различий между районами охватывает ячейки (показано желтым цветом) и пустой фон области путем анализа передовых гистограммы. Ранозаживляющее анализ основан на три шага алгоритма, который обнаруживает монослое клеток, находит разрыва раны и определяет ширина зазора. Эти действия проводятся в моменты времени, определяемые пользователем, и данные представлены как крытой площади, ширина зазора и разрыв области. Одним из главных преимуществ этой машины является, что он позволяет изображений адэрентных клеток через жидкости из-за угла камеры21. Изображения камеры lenstakes наклонена, которые, согласно прогнозам, z стек одной плоскости z генерировать для обеспечения того, чтобы фотографии в фокусе (рис. 2). z стеки создаются путем слияния серии фотографий (например 40) перпендикулярно к краю рану и через всю рану. Z стеки позволяет захвата глубины слоя клеток, а также в фокальной плоскости через рану. Кроме того серии изображений могут быть объединены в коллекцию видео изображения, с одним нажатием кнопки.
Мы демонстрируем оптимизированный протокол для обнаружения миграции в линии клеток кератиноцитов HaCaT. Мы проверили, лактоферрин и его N-терминальный пептида, Lactoferricin, от людей и коров, чтобы анализировать их влияние на миграцию, как было продемонстрировано, что эти молекулы имеют многочисленные приложения как антимикробное и иммунной, модулирует молекулы22 , 23. четыре соединения были по сравнению с необработанными HaCaT клеток и эпидермального фактора роста (EGF) был использован в качестве позитивного элемента управления.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Клетки миграция является важным процессом, который влияет на многие аспекты здоровья, таких как ранозаживляющее и рак, и он, таким образом, решающее значение для разработки методов для изучения миграции. Царапинам assay уже давно наиболее распространенных в vitro метод для проверки соединений с анти - и про migration свойства из-за его низкой стоимости и простая процедура. Однако часто сообщили проблема анализа — это совокупность клеток по всему краю нуля. Кроме того для получения данных от assay, изображения различных воздействий необходимо принять в течение времени в точно то же место для сравнения движения миграции. Различные анализа программы могут использоваться для описания скретч закрытия, но они являются трудоемким, неточной и силы циклам изменений температуры. В этом исследовании мы демонстрируем оптимизированный метод для тестирования миграции эффект, например с естественным белки лактоферрина человека и говядину и их N-терминальный пептидные Lactoferricin на линии эпителиальных клеток HaCaT. Решающее значение оптимизация является мыть и нуля в PBS, который устраняет вышеупомянутых накопления клеток вдоль края. Это можно объяснить путем удаления катионы, которые показали, чтобы иметь влияние на связи клеток кератиноцитов. Чтобы верно обнаружения миграции, предварительной обработки с митомицин C, ингибитор синтеза ДНК, был добавлен к протоколу. Наконец мы демонстрируем автоматизированных оптической камеры, которая исключает чрезмерное температурных циклов, ручной труд с нуля закрытия анализа, улучшения на воспроизводимость и обеспечивая анализ идентичных секций нуля с течением времени.

HaCaT — линия клеток кератиноцитов, один из самых распространенных типов клеток в коже. Когда происходит рану, клетки кожи начинают размножаться и мигрируют через рану спать, чтобы закрыть рану (рис. 3). Оба процесса являются, таким образом, первостепенное ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Здесь мы опишем процедуру тест ячейка миграции в пробирке с автоматической оптической камеры микроскопа. Царапинам assay широко используется где закрытие нуля следуют за определенный период. Оптический микроскоп обеспечивает надежный и дешевый обнаружение миграции клеток.

Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Полуавтоматическая оптического анализа Heartbeat малых сердца

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Индукция и тестирование Гипоксия в культуре клеток

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для<em&gt; In Vitro</em&gt; Изучение ангиогенеза

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Подготовка клеточных экстрактов cryogrinding в автоматизированной морозильной мельницы

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Автоматизированное производство человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных корковых и дофаминергических нейронов с интегрированным мониторингом live-Cell

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...