Name: optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Danska rådet för oberoende forskning, teknik och produktion, bevilja #4005-00029

Den experimentella setup har inga etiska och juridiska restriktioner och genomfördes i samförstånd med Roskilde universitet. En översikt över experimentella set-up kan ses i figur 1 och mekanismerna för optisk kameran i figur 2.
1. beredning
<ol><li>Utföra alla steg i en steril laminärt flöde-bänk av rengöring bänken och alla utrustning med 70% etanol före starten av experimentet.</li>
	<li>Placera optisk kameran i en k...

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Vikten av migration i studier av utveckling, sårläkning, immunologi och cancer har lett till flera olika metoder att studera migration. Migration kan antingen vara ett uttryck för expansion eller nedläggning av klyftan av celler. Oftast stängning av scratch testas, eftersom det är lättare att odla cellerna i en enskiktslager och sedan göra en repa än växer cellerna i ett visst formulär8. Vår studie visar en optimerad metod för manuell avlysningen, eftersom tekniken är lätt att bemä...

Migration är en viktig process som påverkar flera fysiologiska aspekter. Vid sårläkning underlättar migrering re epithelization av huden. I icke-läkande sår, till exempel kroniska sår, opportunistiska bakterier orsaka infektion i såret, och öppna sår är idealisk för bakterietillväxt och bildande av biofilm1,2. Biofilm är en av orsakerna till utvecklingen av resistenta bakterier, som är en av de största hoten mot vårt moderna samhälle3. Vid sårläkning, immuncellerna kan inte tränga igenom biofilmen. I cancer är migration av cancerceller ett avgörande steg för metastaser, vilket är den primära dödsorsaken för patienter med solida tumörer4,5. Därför är det avgörande att kunna studera migration.
Scratch analysen används ofta för att testa cellmigration eftersom det är billigt och enkelt att utföra på vidhäftande cellinjer, såsom fibroblast, endotelceller, och epitelceller linjer6,7. Idag finns flera metoder för att utföra repor8, och olika material har rapporterats till användas, inklusive tandpetare9, cell scrapers10, lasrar11och elektriska strömmar12. Alla metoder har olika för- och nackdelar, och metoden bör beslutas enligt verktyget cell typ, budget och analys. Som ett exempel, om används celltyp kräver beläggning, manuellt tryck borttagning, e.g. med en tandpetare eller pipetten spets, kommer att påverka migrationen inom området, en annan metod bör användas. I denna studie kommer vi att fokusera på manuell skrapning.
En nackdelen för manuell skrapning är variationen i storlek, former av repor och ansamling av cell på kanterna av scratch. Många protokoll finns, och ett högt citerade papper råder ökad hastighet och/eller grundlig tvätt efter klia13. Dessutom har flera metoder använts för att minimera spridning, eftersom spridningen av cellerna inte kan särskiljas från migration och därför kan ge falskt positiva resultat av migration. Några rapporterade metoder är serum svält föregående scratch14 och minska mängden serum15. Ingen av dessa metoder kan dock se till att det finns ingen spridning. Vi redovisar därför en förbehandling av cellerna med mitomycin C att säkerställa sann resultat av migration. Mitomycin C är ett antibiotikum som hämmar DNA-syntes genom att bilda en kovalent bindning med DNA, vilket förhindrar att separera16i DNA. Genom förbehandlas med mitomycin C och tvätta med PBS innan repor, visar detekterade stängningen av klyftan sant migration av cellerna (figur 1).
Ett kännetecken av alla metoder är behovet av ett system för att analysera processen för migration17. En gemensam och en billig metod att analysera framsteg är att använda en ljus-fält Mikroskop för att ta bilder av scratch vid förutbestämda tidpunkter, följt av en analys av stängningen av klyftan i en bild programvara18,19. Denna metod är tidskrävande, opålitliga när det gäller att ta bilder på samma plats och fokus, och rörelsen från inkubatorn till kamera tvingar cykler av temperaturförändringar medan bilderna är tagna. Andra metoder har utvecklats för att upptäcka migration genom att mäta strömflödet. Aktuella ändringar, som celler täcka mer utrymme på plattan, som läses som en ökning i impedans20. Genom att mäta impedans, miljön i cellerna påverkas inte, och därför anses vara icke-invasiv. Denna metod förlitar sig på specialiserade plattor med guld elektroder, som är dyra, men de möjliggör detektering av många processer, såsom cellulär följsamhet, spridning, migration och celldöd. En stor nackdel med denna metod är att impedans mätningen inte tyder på direkt migrering, eftersom faktorer som temperatur har en stor inverkan på impedans. Förändringar i impedans kan orsakas av flera faktorer som inte granskas av mjukvaran, försvårar analysen av data. Bristen på visualisering kräver därför en konventionell ljusmikroskop att kontrollera migration.
För att övervinna många av nackdelar av tillgängliga teknik, använder vi en realtid automatiserad optisk kamera. Optiska kameran är ett system för upptäckt med ett högt dataflöde Mikroskop i en liten plattform med en lins, belysning enhet och en digitalkamera. Den har en inbyggd programvara, som kan testa migration och spridning bland annat. För att upptäcka migration, används två algoritmer för att analysera tillväxt och migration kineticsen av celler, som kallas spridning och de sårläkning analys, respektive. Spridning analysen är baserad på en två-stegs bild segmentering algoritm som gäller textur analys för att upptäcka skillnaden mellan cell-täckt områden (visas i gult), tom bakgrund områden av avancerade histogram analys. De sårläkning analys bygger på en tre-stegs-algoritm som upptäcker den cell enskiktslager, lokaliserar såret klyftan och bestämmer mellanrummet. Här bedrivs vid användarstyrda tidpunkter och data presenteras som täckt område, mellanrummet och gap område. En av de stora fördelarna med denna maskin är att det möjliggör avbildning av vidhäftande celler genom vätska på grund av vinkeln på kameran21. Lenstakes lutas kamerabilderna som projiceras till en z-stack på en enda z-plan generera för att säkerställa att bilder är i fokus (figur 2). z-stackar genereras genom en sammanslagning av serien av bilder (t.ex. 40) tagna vinkelrätt till såret kanten, och över hela såret. Z-stackarna kan fånga av djupet av det cell-lagret samt ett i-fokus planet över såret. Dessutom kan serien bilder sättas ihop till en videosamling i bilderna, med en knapptryckning.
Vi visar ett optimerat protokoll för upptäckt av migration i keratinocyter cell linje HaCaT. Vi testade Laktoferrin och dess N-terminala peptid, Lactoferricin, från människor och kor, för att analysera deras effekt på migration som dessa molekyler har visat sig ha många tillämpningar som antimikrobiella och immunförsvaret modulerande molekyler22 , 23. de fyra föreningarna var jämfört med obehandlade HaCaT celler och epidermal tillväxtfaktor (EGF) användes som en positiv kontroll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Cellmigration är en viktig process som påverkar många aspekter av hälsa, såsom sårläkning och cancer, och det är därför avgörande för att utveckla metoder för att studera migreringen. Scratch analysen har länge varit den vanligaste in vitro- metoden att testa föreningar med anti - och pro - migration egenskaper på grund av dess låg kostnad och enkel procedur. Ett ofta rapporterade problem i analysen är dock ansamling av celler över kanten av scratch. Dessutom för att få data från analysen, måste bilder med olika exponeringar tas över en tidsperiod på exakt samma plats att jämföra förehavanden av migreringen. Olika analysprogram kan användas för att beskriva scratch nedläggningen, men de är arbetsintensivt, felaktig, och krafter cykler av temperaturförändringar. I denna studie visar vi en optimerad metod för att testa effekten migration, e.g. med de naturligt förekommande proteinerna mänskliga - och nötkreatur-Laktoferrin och deras N-terminala peptid Lactoferricin på raden epitelial cell HaCaT. En avgörande optimering är att tvätta och skrapa i PBS, vilket eliminerar nämnda ansamling av celler längs kanten. Detta kan förklaras genom avlägsnande av katjoner, som har visat sig ha en effekt på keratinocyter cell-cell-anslutning. För att säkerställa sann upptäckt av migration, lades förbehandlas med mitomycin C, en hämmare av DNA-syntes, till protokollet. Slutligen visar vi automatiserad optisk kameran, vilket eliminerar hög temperatur cykler, kroppsarbete med scratch stängning analys, samtidigt förbättra på reproducerbarhet och garanterar analys av identiska sektioner av scratch över tid.

HaCaT är en keratinocyter cellinje, en av de vanligast förekommande typerna av celler i huden. När ett sår uppstår, börja hudceller föröka sig och migrera över till såret sängen att stänga såret (figur 3). Båda processerna är därför av yttersta vikt för korrekt läkning.
Optiska kameran kan följa båda processer i realtid. För migration, systemet ger tre datauppsättningar: cell ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Här beskriver vi ett förfarande för att testa den cell migration in vitro- med en automatiserad optisk kamera Mikroskop. Scratch analysen har använts allmänt om stängningen av scratch följs under en fastställd period. Det optiska mikroskopet ger pålitlig och billig detektering av cellmigration.

Optimerad Scratch test för In Vitro tester av cellmigration med en automatiserad optisk kamera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

The main advantage of this technique is that you can look at the cells real time in the automatic optical microscope. The implications of this treatment extends to a therapy of chronic wounds or cancer where migration plays a crucial role in these diseases. Begin by washing a confluent culture of HaCaT cells two times with five milliliters of sterile magnesium and calcium free PBS per wash.Next, incubate the cells with one milliliter of trypsin in a 37 degree Celsius incubator for five to eight minutes. After confirming detachment under a light microscope stop the enzymatic reaction with nine milliliters of culture medium supplemented with FBS. And dilute the cells to a 7.5 times 10 to the fourth cells per 250 microliters of medium plus FBS concentration.Next, seed 250 microliters of cells to each well of a round-bottomed 48-well tissue culture plate, and gently slide the plate from side to side to ensure the cells are equally distributed across the well bottoms. Then transfer the plate to a cell culture incubator. When the cultures have reached a 90 to 95%confluency, replace the supernatant in each well with 250 microliters of freshly prepared medium supplemented with 10 micrograms per milliliter of mitomycin C, and return the plate to the incubator for another two hours.At the end of the incubation wash the cells with 250 microliters of PBS and add 250 microliters of fresh PBS to each well. Then use a 200 microliter micropipette tip to make one vertical scratch in each cell monolayer. When all of the monolayers have been scratched replace the PBS in each well with 250 microliters with the peptide stimulus of interest and mount the plate into an optical camera system with the lid intact.To set up the optical camera open the acquire window and select wound healing. Select the plate type and unselect the wells not in use. Next click enable and right click on one of the wells to adjust the focus to fit the position of the cells.Set the time period for the images under picture interval and set the number of repetitions to fit the desired period. Then select the appropriate analysis type. Then click start to begin imaging the cells.When a wound occurs the skin cells begin to proliferate and to migrate across the wound bed to close the wound, a process that can be observed through the optical camera. After a 48-hour incubation endothelial growth factor treatment induces a nearly 95%closure of the wound, compared to a 38%closure in the untreated control wells, and 33 and 62%closures in the lactoferrin and lactoferricin cultures respectively. The percentage of wound closure determined from changes in gap width from the initial scratch can also be plotted for each growth stimulus.This video describes a straightforward and efficient protocol for studying migration of keratinocytes across a scratch made in a monolayer of healthy cells. Though the cells used in this assay is HaCaT cells, the method can also be applied on other cell lines, fungi, or even bacteria, as long as they are adherent to the bottom of the microtiter plate.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

En In vitro FluoroBlok tumör Invasion analys

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion och testning av Hypoxi i cellodling

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration och Invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcell Tube Formation analys för<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie av angiogenes

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Beredning av Cell Extrakt av Cryogrinding i en automatiserad Frys Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatiserad produktion av humant inducerat Pluripotent Stamcell-derived kortikal och dopaminerga nervceller med integrerad Live-Cell Övervakning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...