Name: ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (15K 07147, 17K 07419) von JSPS (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), ein Inamori Foundation Research Grant (auf HI) und das Programm der gemeinsamen Nutzung/Forschungsstelle für Entwicklungsstörungen Medizin bei Das Institut für Molekulare Embryologie und Genetik, Kumamoto Universität (HS). Wir danken Dr. Azusa Kamikouchi und Herr Daichi Yamada für ihre Hilfe im Umgang mit dem abbildenden System.

1. Vorbereitung des larvalen Gehirn Explantaten
<ol><li>Machen Sie eine bildgebende Kammer. Hinweis: Stabile Aufnahme erfordert, dass die Gehirn Explantaten angebunden werden. Hier ist eine günstige, handgefertigte bildgebende Kammer in die Ca2 + imaging-System verwendet.<ol>
<li>Mit Pinzette, kratzen Sie unten in der Mitte von einem Kunststoff Kulturschale (35 mm x 10 mm) erstelle ich eine delle für die ventralen Ganglion des larvalen Gehirns machen Montage einfacher (Schritt 1.3, ...

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

Die Ca2 + imaging hier beschriebene Methode ist ein nützliches System zum Testen der Funktion der Hormone im Gehirn. In-vivo, das Gehirn erhält Hormone von verschiedenen endokrinen Organen. Darüber hinaus sieht das Gehirn ständig aufsteigende sensorische Informationen, wodurch spontanen neuronalen Aktivierung. Diese ex-Vivo -System beseitigt wie Lärm und ergibt ein besseres Signal-Rauschverhältnis als in-Vivo Bildgebung. In diesem System können Moleküle einzeln oder in Kombin...

Orgel, Orgel-Kommunikation ist eine evolutionär konservierte Strategie für die Aufrechterhaltung der Homöostase um Veränderungen der Umwelt gerecht zu werden. Bei Menschen, eine Vielzahl von Hormonen Arereleased von den endokrinen Drüsen in den Blutkreislauf. Viele dieser Hormone gezielt im Hypothalamus des Gehirns, die Stoffwechselprozesse und grundlegende Verhaltensweisen wie Fütterung1,2regelt. Viele Hormone sind mit Säugetieren Modelle entdeckt worden. Die Mechanismen ihres Handelns, vor allem die interorgan Netzwerke, an denen sie teilnehmen, bleiben jedoch weitgehend unklar.
Drosophila Melanogaster hat ein nützliches Modell für das Studium der Orgel, Orgel-Kommunikation entwickelt. Bei Insekten sind viele physiologische Prozesse durch Hormone gesteuert. Frühe Studien mit Schwerpunkt auf Wachstum und Metamorphose verwendet große Insekten. In diesen Studien vorhergesagt die Entfernung oder die Transplantation von bestimmten Organen die Existenz von Inter Orgel Signalmoleküle; später wurden Juvenilhormon (JH), Prothoracicotropic Hormon (PTTH) und Ecdyson biochemisch gereinigten3,4,5. Eine große Familie von interzellulären Signalisierung Peptide wird gedacht, um während der Insekten Lebenszyklus6,7in verschiedenen physiologischen Ereignisse einbezogen werden. Die meisten dieser Peptide wirken auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), obwohl die spezifische GPCRs zunächst schwer zu identifizieren, mit herkömmlichen Ansätzen waren. Die Veröffentlichung der Drosophila ganze Genom-Sequenz8 war der Durchbruch, der die Identifizierung von Drosophila bioaktiven Peptiden basierend auf ihre Homologie mit denen in anderen Insekten aktiviert. Darüber hinaus wurden die Rezeptoren für verschiedene Peptide von GPCRs vorhergesagt im Genom mit Kultur-zellbasierte GPCR-Ligand verbindliche Tests identifiziert. Als nächstes vorhergesagt Expressionsanalysen die Orgel, Orgel-Wege ausgelöst durch diese Peptide und Rezeptoren. Insbesondere werden viele der vermeintlichen Peptid-Rezeptoren ausgedrückt im Gehirn, was darauf hindeutet, dass das Gehirn ein wichtiges Ziel von Peptid-Hormone-9. Darüber hinaus haben die genetische Sonderwerkzeuge in Drosophila zur Identifizierung der physiologischen Rollen von Peptid-GPCR Kombinationen beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die GAL4 und LexA binäre transkriptionelle basierenden gen-Knockdown oder Überexpression räumlich und zeitlich kontrolliert. GAL4, einen Transkriptionsfaktor identifiziert in Hefe, bindet an eine bestimmte Cis-regulatorische Sequenz genannt Upstream Aktivierung Sequenz (FH). In das GAL4/UAS-System die Treiber Line bietet gewebespezifischen oder Bühne-spezifische GAL4 Ausdruck und die Responder-Linie trägt UAS stromaufwärts des Gens von Interesse oder das Konstrukt Laufwerk ShRNA Ausdruck. LexA/LexAop System basiert auf einem ähnlichen Mechanismus. Phänotypische Analysen der gewebespezifischen Peptid-Zuschlag und gewebespezifische GPCR-Zuschlag Tiere können Informationen über die Peptid-GPCR Signalisierung Modus und Ort des Geschehens zeigen. Allerdings beschränken sich die Schlussfolgerungen, die allein durch genetische Daten erreicht werden können. Auf der anderen Seite sobald das vermeintliche Ziel ein bestimmtes Peptidhormon zu einem Gewebe oder Zellen Typ eingegrenzt, ex Vivo Kalzium imaging in Orgel Explantaten lässt sich die Orgel, Orgel-Kommunikation vermittelt durch Peptid-GPCR Signalisierung zu erhellen. Nach der Aktivierung eine Gq gekoppelt GPCR wird die intrazelluläre Ca2 + Konzentration durch die Freisetzung von Ca2 + aus dem ER10erhöht. Im Gehirn erhebt neuronalen Aktivierung auch die intrazellulären Ca2 + Ebenen. Diese Ca2 + Erhöhungen können durch eine Kalzium-Sensor, GCaMP, erkannt werden die Konformationsänderungen im Beisein von Ca2 + was Fluoreszenz Emission11erfährt.
In diesem Artikel wird ein Kalzium, die bildgebendes Verfahren mit Drosophila Gehirn explants beschrieben. Um die Fähigkeit eines Peptids, spezifische Neuronen aktivieren zu testen, wird eine Test-Peptid auf GCaMP exprimierenden Gehirn Explant angewendet und Fluoreszenz-Änderungen werden von konfokalen Mikroskopie überwacht. Die Einbeziehung der GPCR ist dann bestätigt, indem Sie den gleichen Test mit einem mutierten Gehirn fehlt der GPCR durchführen. Diese Kombination von Bildgebung und Genetik liefert präzise Informationen über die Orgel, Orgel-Kommunikation durch Peptide-GPCRs. möglich Änderungen und Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls behandelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Orgel, Orgel-Kommunikation durch endokrine signalisieren, beispielsweise ist von der Peripherie zum Gehirn, unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase. Drosophila Melanogaster, die genetische Werkzeuge und Genominformationen anspruchsvoll ist, wird als Modell Tier für endokrine Forschung verstärkt eingesetzt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die Kalzium-Bildgebung von Drosophila Gehirn Explantaten. Diese Methode ermöglicht die Erkennung von der direkten Signalisierung eines Hormons im Gehirn. Es ist bekannt, dass viele Peptidhormonen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) handeln, dessen Aktivierung eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +Konzentration bewirkt. Neuronalen Aktivierung erhebt auch intrazelluläre Ca2 + Ebenen, von Ca2 + Zustrom und die Freisetzung von Ca2 + in das endoplasmatische Retikulum (ER) gespeichert. Ein Kalzium-Sensor, GCaMP, kann diese Ca2 + Änderungen überwacht werden. Bei dieser Methode wird GCaMP in den Neuronen des Interesses ausgedrückt, und das GCaMP mit dem Ausdruck ihrer Larven Gehirn seziert und kultiviert ex Vivo. Das Test-Peptid ist dann auf das Gehirn Explant angewendet, und die fluoreszierenden Änderungen in GCaMP werden erkannt mit einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet. Mit dieser Methode ein wasserlösliches Molekül kann getestet werden, und verschiedene zelluläre Ereignisse im Zusammenhang mit neuronalen Aktivierung können mit Hilfe der entsprechenden fluoreszierenden Indikatoren abgebildet werden. Darüber hinaus kann durch Ändern der bildgebenden Kammer, diese Methode verwendet werden, zum anderen Drosophila Organe oder Organe anderer Tiere Bild.

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde die Aktivierung des Gehirns Insulin-produzierenden Zellen (IPCs) durch das Peptidhormon, CCHa2, untersucht. IPCs des Wildtyp Gehirns wurden mit GCaMP6s beschriftet mit einer Kombination aus dilp2 -GAL412 (ein Geschenk von Dr. Rulifson) und FH-GCaMP6s13 (ein Geschenk von Dr. Kim). Larval Gehirn Explantaten mit einem synthetischen CCHa2 Peptid behandelt wurden, und die Fluoreszenz von...

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

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The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

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In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

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The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

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