Name: ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Grants-in-Aid para pesquisa científica (15K 07147, 17K 07419) de JSPS (para Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), uma bolsa de investigação Inamori Foundation (para HI) e o programa de centro de uso/pesquisa conjunta para medicina do desenvolvimento, em o Instituto de embriologia Molecular e genética, Universidade de Kumamoto (para HS). Agradecemos o Dr. Azusa Kamikouchi e Sr. Daichi Yamada por sua ajuda na utilização do sistema de imagem.

1. preparação do cérebro Larval explantes
<ol><li>Fazer uma câmara de imagens. Nota: A gravação estável requer que os explantes de cérebro estar amarrados. Aqui, uma câmara de imagem de baixo custo, feito à mão é usada no Ca2 + sistema de imagem.<ol>
<li>Usando fórceps, arranhe o fundo centro de um prato de cultura plástico (35 x 10 mm) para criar um dente para o gânglio ventral do cérebro larval tornando a montagem mais fácil (etapa 1.3, Figura 1).</li>
		<l...

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

O Ca2 + imagem método descrito aqui é um sistema útil para testar o funcionamento dos hormônios no cérebro. In vivo, o cérebro recebe hormônios de vários órgãos do sistema endócrino. Além disso, o cérebro constantemente vê crescente de informações sensoriais, que provoca a ativação neuronal espontânea. Este sistema ex vivo elimina tal ruído e produz uma relação sinal/ruído melhor do que na vivo de imagem. Neste sistema, as moléculas podem ser testadas isoladam...

Órgão-órgão-a comunicação é uma estratégia evolutivamente conservada para manter a homeostase para lidar com as mudanças ambientais. Em humanos, uma variedade de arereleased de hormônios das glândulas endócrinas na circulação. Muitos desses hormônios como alvo o hipotálamo do cérebro, que regula os processos metabólicos e comportamentos fundamentais tais como alimentação1,2. Muitos hormônios foram descobertos usando modelos de mamíferos. No entanto, os mecanismos de sua ação, especialmente as redes interorgan, em que participem, permanecem em grande parte obscuro.
Drosophila melanogaster emergiu como um modelo útil para estudar órgão-para-órgão comunicação. Em insetos, muitos processos fisiológicos são controlados pelos hormônios. Primeiros estudos centrada no crescimento e metamorfose usado grandes insetos. Nesses estudos, a remoção ou transplante de órgãos específicos previu a existência de moléculas sinalizadoras órgãos inter; mais tarde, hormônio juvenil (JH), hormônio Prothoracicotropic (PTTH) e isoinokosterone foram bioquimicamente purificada3,4,5. Uma grande família de peptídeos de sinalização intercelulares é pensada para ser envolvido em vários eventos fisiológicos durante o ciclo de vida de inseto6,7. A maioria destes peptídeos atuam sobre G-receptores (GPCRs), embora os GPCRs específicos foram inicialmente difícil identificar abordagens convencionais. A publicação do genoma de Drosophila sequência8 foi a descoberta que permitiu a identificação de peptídeos bioativos de Drosophila baseada sua homologia aos encontrados em outros insetos. Além disso, identificaram-se os receptores para vários péptidos de GPCRs previstos no genoma usando ensaios de ligação GPCR-ligante cell-cultura-based. Em seguida, as análises de expressão previram os caminhos de órgão-para-órgão eliciados estes peptídeos e receptores. Notavelmente, muitos dos receptores de peptídeos putativos são expressos no cérebro, sugerindo que o cérebro é um alvo principal do peptídeo hormônios9. Além disso, as ferramentas avançadas de genéticas em Drosophila têm contribuído para a identificação de funções fisiológicas das combinações de peptídeo-GPCR. Por exemplo, a GAL4 e LexA-baseado sistemas binários transcriptional permitem knockdown do gene ou superexpressão de forma controlada espacial e temporalmente. GAL4, um fator de transcrição identificado no fermento, vincula-se a uma sequência de cis-regulamentação específica denominada sequência de ativação Upstream (UAS). No sistema GAL4/UAS, linha excitador fornece tecido-específica ou expressão de GAL4 estágio específico e a linha de respondente carrega UAS montante do gene de interesse ou a construção, a expressão de shRNA de unidade. LexA/LexAop sistema é baseado em um mecanismo semelhante. Análise fenotípica de animais de GPCR-nocaute de peptídeo-knockdown e tecido-específica de tecido-específica pode revelar informações sobre modo do peptídeo-GPCR sinalização e local de ação. No entanto, as conclusões que podem ser alcançadas apenas por dados genéticos são limitadas. Por outro lado, uma vez que o alvo putativo de um hormônio peptídeo específico é reduzido a um tipo de tecido ou célula, cálcio ex vivo de imagem em explantes de órgão pode ser usado para elucidar a órgão-para-órgão comunicação mediada por sinalização de peptídeo-GPCR. Após a ativação de um GPCR Gq-acoplado, a concentração intracelular de Ca2 + é aumentada devido à liberação de Ca2 + do ER10. No cérebro, ativação neural também eleva os níveis intracelulares de Ca2 + . Tais aumentos de Ca2 + podem ser detectados por um sensor de cálcio, GCaMP, que sofre mudanças conformacionais na presença de Ca2 + resultando em emissão de fluorescência11.
Neste artigo, é descrito um método de imagem usando o cérebro de Drosophila explants de cálcio. Para testar a capacidade de um peptídeo para ativar os neurônios específicos, um peptídeo de teste é aplicado para o explante cérebro GCaMP-expressando, e mudanças de fluorescência são monitoradas pela microscopia confocal. O envolvimento do GPCR é então confirmado, realizando o mesmo ensaio usando um cérebro mutante falta GPCR. Esta combinação de genética e de imagem fornece informações precisas sobre o órgão-para-órgão de comunicação por peptídeos-GPCRs. possíveis modificações e aplicações do presente protocolo são também discutidas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Órgão-órgão-a comunicação por sinalização endócrina, por exemplo, da periferia para o cérebro, é essencial para manter a homeostase. Como um animal de modelo para a investigação do sistema endócrino, Drosophila melanogaster, que tem sofisticadas ferramentas genéticas e informação do genoma, está sendo usado cada vez mais. Este artigo descreve um método para o tratamento de imagens de cálcio de explantes de cérebro de Drosophila . Esse método permite a detecção da sinalização direta de um hormônio no cérebro. É sabido que muitos Hormônios peptídicos agem através de receptores G-proteína-acoplados (GPCRs), cuja ativação causa um aumento na concentração Ca2 +intracelular. Ativação neural também eleva intracelular Ca2 + níveis, do influxo de Ca2 + e a liberação de Ca2 + armazenados no retículo endoplasmático (ER). Um sensor de cálcio, GCaMP, pode monitorar essas mudanças de Ca2 + . Neste método, o GCaMP é expresso nos neurônios de interesse, e o cérebro larval GCaMP-expressando é dissecado e culta ex vivo. O teste de peptídeo é então aplicado ao explante cérebro, e as alterações fluorescentes em GCaMP são detectadas usando um microscópio confocal de fiação disco equipado com uma câmera CCD. Usando este método, qualquer molécula solúvel em água pode ser testada, e diversos eventos celulares associados a ativação neural podem ser fotografados usando os indicadores fluorescentes apropriados. Além disso, modificando a imagem da câmara, este método pode ser usado para a imagem de outros órgãos de drosófila ou os órgãos de outros animais.

Usando este protocolo, a ativação do cérebro células produtoras de insulina (IPCs) pelo hormônio peptídeo, CCHa2, foi examinada. IPCs do selvagem-tipo cérebro foram rotulados com GCaMP6s usando uma combinação de dilp2 -GAL412 (um presente do Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s13 (um presente do Dr. Kim). Larval cérebro explantes foram tratados com um peptídeo sintético de CCHa2, e a fluorescência de GCaMP6s foi gravada...

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

This method can help answer key questions in the endocrinology field, as well as the neuroscience field, such as our research to review brains responses to endocrine signals. The main advantage of this technique is that you can examine direct effects of endocrine signals on the brain separated from other tissues. To begin this procedure, use forceps to scratch the bottom center of a plastic culture dish to create a dent for easier mounting of the ventral ganglion of the larval brain after dissection.With a toothpick, place a small drop of superglue on either side of the dent, and attach a tungsten rod to the glue. Then, using a small piece of putty-like reusable adhesive, make a circular wall surrounding the dent. To dissect the larval brain, 90 to 120 hours after egg laying collect larvae and wash them at least three times with distilled water to remove adherent food debris.Next, place a larva on a square one and a half inch watch glass filled with ice cold PBS. Use a pair of forceps to gently grab the middle part of the larva. Use another pair of forceps to grab and pull the mouth hooks gently to separate the anterior part of the larva containing the brain from the rest of the body.Then, hold the anterior tip with the forceps and turn the larva inside out. Remove the extraneous tissues attached to the brain, such as imaginal discs, fat bodies, and ring gland. Gently separate the brain from the mouth parts.Afterwards, apply 200 microliters of PBS to the inside of the adhesive ring prepared earlier in the imaging chamber. Gently suck the dissected brain with PBS into a Pasteur pipette, and transfer it to the imaging chamber. In the imaging chamber, grab the muscle fibers extending from the ventral ganglia and insert the brain gently into the dent underneath the tungsten wire.Then, pull the tungsten wire slightly up to place the brain at the correct position for imaging. To acquire calcium fluorescence images, place the imaging chamber containing the brain explant under the microscope. Lower the objective lens until it touches the PBS, and under bright field illumination position the brain and bring it into focus.Switch to fluorescent light and adjust the focus on the GCaMP success labeled cells. Start the acquisition at 250 ms/frame, at a resolution of 512 x 512 pixels in water cooled mode. Then, adjust the exposure time to obtain the fluorescence values within the CCD camera dynamic range, but not lower than 1000 arbitrary units with 16 bit images.Once the imaging parameters are determined, take the images for one minute before peptide administration to detect baseline signal intensities. Subsequently, apply the test peptide directly, by pipetting 100 microliters of the prepared peptide solution into the larval bath. Record the GCaMP success emission for a few minutes.To analyze the data, open the analysis software and use the first frame which was before peptide application as a reference image. Then, select Plugins, TurboReg. Choose the serial image file as the Source, and the reference image as the Target.Next, check Rigid Body and Accurate for the processing method and quality, respectively. Subsequently, click Batch to start image processing. Select multiple regions of interest by using Analyze, Tools, ROI Manager, in image tray.Then, measure the pixel intensity by clicking More, Multi Measure, OK, in the ROI Manager window. In this experiment, Wild type brain was exposed to CCHa2, Ghrelin, and Nociceptin, whereas CCHa2 Receptor mutant brain was exposed to CCHa2. GCaMP6 signals in insulin producing cells were detected by confocal microscopy at 250 ms/frame, and here are the still images of selected time points.The ratio of the change of ROI intensity to baseline signal intensity at each time point was plotted. ROIs where set on cell bodies that were detected in the same focal plane. The solid lines indicate the mean of five to 10 samples, and the dotted lines mark upper and lower limits of the standard error of the mean.The shaded areas indicate the variation of the signals in the experiments. Once mastered, this technique can be done in one hour, if it is preformed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to prepare the brain sample quickly, to avoid damage to it.This procedure can be combined with genetics in order to answer additional questions like on receptor specificity. The system used in this protocol is easy to prepare and reusable. Thus, this protocol will be useful for, like in screening.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of endocrinology and neuroscience to explore hormonal networks that control brain function in Drosophila.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociência

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Author Spotlight: Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus 

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...