Name: computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

ونشكر ميكرويماجينج موناش لتقديم الدعم التقني لهم. وقدمت بعض سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). هذا العمل كان يدعمها زمالة اكتشاف الطب الحيوي جامعة موناش، ومنحة مشروع NHMRC (GNT1105374)، NHMRC أقدم زمالة بحثية (GNT1137645) والزمالة الابتكار فيسكي: 23 VIF لروجر بوكوك.

1-إعداد وتربية دودة
ملاحظة: تشير الجدول للمواد لجميع معلومات المنتج.
<ol><li>OP50 الإشريكيّة القولونية الثقافة: الثقافة البكتيريا OP50 في مرق ليسوجيني (رطل) (تريبتوني 1%، الخميرة 0.5%، 0.5% كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المضادات الح...

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li><li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li><li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans.">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).</li><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+sperm/oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li><li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-3+and+control+of+the+mitosis/meiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans.">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li><li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis.">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1,+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors.">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

والهدف من هذا البروتوكول هو تحسين الدقة وتقليل الوقت اللازم لتحليل الخط. بعد إعداد قياسية من جيرملينيس تشريح، إعداد نموذج ثلاثي الأبعاد لنوى germline التقديم الحسابي. بينما يسمح لمراقبة توزيع الأنوية germline في الفضاء، التقديم ثلاثي الأبعاد بحساب عدد الأنوية في مناطق محددة الفعل. الجوانب البال...

يجعل المحافظة على إشارات المسارات مع الثدييات C. ايليجانس نموذجا ممتازا لدراسة متعددة العمليات البيولوجية1،2. في لدينا مختبر، نستخدم germline C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا الجذعية، والمبرمج، والتعبير الجيني. بينما الفعل هيكل ثلاثي الأبعاد، العديد من الدراسات وهما الأبعاد نظراً لطبيعة تحليل ثلاثي الأبعاد تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة. أنه من المحتمل جداً أن تحليل الأبعاد قد تشوه في فيفو الأحداث في الفعل. وقد خنثي الكبار C. ايليجانس هما germline الأسلحة، كل منها يضم خلية جسدية نصيحة القاصي (DTC) الذي يحافظ على الخلايا الجرثومية القاصي في3،دولة غير متمايزة4. هذه الخلايا الجرثومية ابدأ أن يميز أنها تتحرك بعيداً عن DTC، الإفلات من تأثيرها، وتصبح بويضات والحيوانات المنوية كما أنها تصل إلى نهاية الدانية الفعل. وخلال هذه العملية، يخضع نواة الخلية الجرثومية الانقسام، قبل الانتقال إلى الانقسام الاختزالي5،6. اكتمال إنتاج الحيوانات المنوية بمرحلة اليرقات 4 (L4) التنمية، وبعد ذلك يتم إنتاج بويضات خلال مرحلة البلوغ. يتم تخزين الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا حيث أنها تخصب بويضات لتوليد أجنة.
وهناك العديد من العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على التنمية germline في C. ايليجانس أسفر عن تغييرات في عدد الأنوية، عدد من الأحداث أبوبتوتيك، وديناميات كروموسوم، وتعبير البروتين و/أو التعريب7 ،،من89،،من1011. تحليل هذه الأحداث تتطلب تحديد كل مرحلة من التمايز على أساس مورفولوجيا النووية والتوزيع. لدقة تحليل هذه المعلمات يدوياً مع حجم عينة كبيرة كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً. للالتفاف على هذه العيوب، ولتمكين اتساق التحليل، قمنا بتطوير أسلوب الآلي لفحص ثلاثي الأبعاد ل germline C. ايليجانس للنوى العد، وتوزيع الأنوية، تعبير البروتين، وسيتوسكيليتال الهيكل. بالجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] التقديم ثلاثي الأبعاد، نحن إنشاء معلمات حجم وشكل للتعرف على كل مرحلة من تمايز الخلية الجرثومية. علاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب عد نواة الخلية الجرثومية والحيوانات المنوية بالإضافة إلى سجل لعدد الصبغيات في كل البويضات.
هيكل حاسم واحد في الفعل هو سيتوسكيليتون، الذي يوفر الاستقرار إلى حجرة germline والجري هيولى الإيدز والحماية بالفعل أنوية12. استخدام التقديم الحسابية، نحن إجراء إعادة البناء ثلاثي الأبعاد ل germline cytoskeleton وتحديد السمات المميزة سيتوسكيليتال ضمن الفعل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح التحليل الحسابي كيف جنبا إلى جنب مع [كنفوكل] التصوير يتيح تحليلاً شاملا ل germline C. ايليجانس .
ونحن نقترح طريقة سريعة لتحليل ثلاثي الأبعاد C. ايليجانس germline (الشكل 1). استخدام تحليل ثلاثي الأبعاد، فمن الممكن لدراسة توزيع ثلاثي الأبعاد من نوى germline (الشكل 2 و الشكل 3)، الآلي عد الخلايا (الشكل 2)، إعادة إعمار cytoskeleton germline ( 3 الرقم)، توزيع البروتينات (الشكل 4)، وسجل عدد الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا والصبغيات في بويضات (الشكل 5). الأسلوب ليس فقط تمكن الكمي سهل ودقيق للخط ولكن يحدد تعمل فسيولوجيا ذات الصلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

يتم استخدام الخط ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) لدراسة عدة عمليات هامة بيولوجيا بما في ذلك ديناميات التنمية والمبرمج وكروموسوم الخلية الجذعية. بينما الفعل نموذجا رائعا، التحليل غالباً اثنان الأبعاد نظراً للوقت والعمالة اللازمة لتحليل ثلاثي الأبعاد. قراءات الرئيسية في مثل هذه الدراسات هي العدد/موقف النوى وتوزيع البروتين ضمن الفعل. نقدم هنا، طريقة لإجراء تحليل الآلي للخط استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] والنهج الحسابية لتحديد عدد وموقف النوى في كل منطقة الفعل. كما يحلل لدينا أسلوب توزيع البروتين germline التي تمكن من فحص ثلاثي الأبعاد للبروتين في التعبير في مختلف الخلفيات الوراثية. علاوة على ذلك، يبين دراستنا الاختلافات في بنية سيتوسكيليتال في مناطق متميزة الفعل أنه يمكن استيعاب متطلبات التنمية المكانية محددة. وأخيراً، تمكن لدينا طريقة العد الآلي للحيوانات المنوية في سبيرماثيكا لكل germline. أخذت معا، تمكن لدينا أسلوب التحليل المظهرية السريع واستنساخه من germline C. ايليجانس .

يشير الرقم 1 إلى الوقت اللازم لتحليل الخط ثلاثي الأبعاد. تشريح لعزل جيرملينيس المنحرفين L4 المحتضنة عند 20 درجة مئوية والملون مع DAPI، فالويدين، والأجسام المضادة ضد germline البروتينات. جيرملينيس يتم تصويرها باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. مجهرية المصبوغة و [كن?...

Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

The overall goal of this method is to automate the analysis of a Caenorhabditis elegans germline to study its nuclei, protein, and cytoskeletal distribution. This method can help answer the key questions in the C.Elegans field about the number of nuclei and sperm, nuclear distribution, and cytoskeletal structure of the germline. The main advantages of this technique are it reduces the analysis time, increases the sample size, and eliminate the human error associated with the manual analysis.To image the samples, place slides with stained germlines into the slide holder above the 63X objective of a confocal microscope, and locate a germline. Focus on the top of the germline, and mark it with the confocal microscope software. When the total germline thickness has been established, define the thickness of each slice up to 0.5 micrometers, and mark the complete germline.Then, start the acquisition, scanning each slice eight times and averaging the values to improve the image quality. When all of the images have been obtained, import the images to an appropriate image analysis software program, and use the surface function tool to select the mitotic region. An image of the distal end of the germline will appear.Cancel the automatic surface creation wizard, and manually draw a region of interest around the mitotic region at the first and last slices of the image from the three-dimensional stack. Click Create Surface, followed by Mask Channel, to mask all of the channels except the DAPI channel. Using the spot function tool, define the size parameters of the mitotic region with an XY diameter of two micrometers and with the Z diameter undefined.Click subtract background to subtract the background. To define the minimum threshold, increase the minimum 3D rendering threshold on a DAPI-stained wild-type germline until the first spot appears outside of the germline, and generate a 3D model for each region. After saving the images, click table to view the number of nuclei, as generated automatically by the software, and export the images as TIFF files.For the transition zone, create surface as explained before. Then, click Mask Channel to mask all the channels except the DAPI channel. Using spot function, define an XY diameter of two micrometers and Z diameter of 1.5 micrometers, and click subtract background to subtract the background.To define the minimum threshold, increase the minimum 3D rendering threshold on a DAPI-stained wild-type germline until the first spot appears outside of the germline, and generate a 3D model for each region. After saving the images, click table to view the number of nuclei, as generated automatically by the software, and export the images as TIFF files. For scoring the sperm number, select the spermatheca as the region of interest, as demonstrated for the nuclei regions, and use the spot function tool to define the XY diameter between 0.75 and one micrometers with an undefined Z diameter to detect each sperm.Select the Background Subtract box, and use the background correction values calculated by the software to subtract the background. Then, adjust the 3D rendering threshold to detect all of the DAPI-stained sperm in the spermatheca. For chromosome counting in the oocytes, select the oocytes and define the XY diameter as less than 0.75 micrometers, and define the threshold before developing the 3D models.Then, save the images for export as TIFF files. For cytoskeletal germline reconstruction, identify the mitotic region of interest in the germline and create a surface mask as previously demonstrated. Click Mask Channels to mask all of the channels except the phalloidin channel, and use the surface function tool to define a surface detail of 0.25 micrometers.After subtracting the background, adjust the 3D rendering threshold to save the developed 3D image for export as a TIFF file. The nuclei distribution is dependent on the stage of differentiation. For example, at the mitotic region, the inner actin appears as a solid mass upon which the nuclei are organized.In a wild-type germline, the mitotic region contains approximately 250 nuclei and is tightly packed with nuclei compared to the rest of the germline. As the nuclei move away from the distal end, however, they appear closer to the circumference of the germline, with the change in distribution starting at the transition zone and finishing as the nuclei enter the third stage of prophase in meiosis. At the transition zone, the germline inner actin assumes a more cylindrical structure, becoming a hollow cylinder as it reaches the pachytene.The second layer of actin covers the inner layer, giving shape to the germline. This cylinder within a cylinder actin structure disappears toward the oocyte region, at which point the actin appears as thick fibers covering the oocytes. In the spermatheca, the actin also forms into thick bundles of fiber, although these fibers appear to be packed more closely together than in the oocyte region.Three-dimensional rendering of the proximal end of the germline, as demonstrated, reveals an average of 151 sperm in each spermatheca. Once mastered, this analysis can be completed in 10 minutes per germline. While attempting this procedure, it is important to remember to define the analysis parameters according to the magnification of the objective used to visualize the germline in your experiment.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform an automatic analysis of a germline and to study cytoskeletal structure and to score the number of the nuclei within the germline.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

صمام عزل وتوصيف للفئران الابتدائي الخلايا الخلالي: نموذج جديد لدراسة تكلس الصمام الابهري

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...