Name: computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

हम उनके तकनीकी समर्थन के लिए मोनाश Microimaging धंयवाद । कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । इस काम के लिए एक मोनाश विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया था एक चिकित्सा डिस्कवरी फैलोशिप, NHMRC परियोजना अनुदान (GNT1105374), NHMRC वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप (GNT1137645) और veski इनोवेशन फैलोशिप: VIF 23 करने के लिए रोजर Pocock.

1. तैयारी और कृमि पशुपालन
नोट: सभी उत्पाद जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
<ol><li>OP50 ई कोलाई संस्कृति: संस्कृति OP50 बैक्टीरिया Lysogeny शोरबा (पौंड) (1% tryptone, ०.५% खमीर, ०.५% NaCl, पीएच ७.०) में रातों...

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li><li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li><li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans.">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).</li><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+sperm/oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans.">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li><li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-3+and+control+of+the+mitosis/meiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans.">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li><li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis.">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis.">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li><li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1,+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors.">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सटीकता में सुधार और germline विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए है । विच्छेदित germlines की मानक तैयारी के बाद, germline नाभिक का एक तीन आयामी मॉडल गणनात्मक प्रतिपादन द्वारा तैयार किया ज?...

स्तनधारियों के साथ संकेत रास्ते के संरक्षण सी. एलिगेंस एक उत्कृष्ट करने के लिए एकाधिक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन1,2मॉडल बनाता है । हमारी प्रयोगशाला में, हम स्टेम सेल विकास, apoptosis, और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए C. एलिगेंस germline का उपयोग करते हैं । जबकि germline एक तीन आयामी संरचना है, कई अध्ययनों से दो समय लेने वाली और श्रम तीन आयामी विश्लेषण के गहन प्रकृति के कारण आयामी हैं । यह बहुत संभावना है कि दो आयामी विश्लेषण germline में vivo घटनाओं में misrepresent हो सकता है । C. एलिगेंस वयस्क द्विलिंग दो germline हथियार है, जिनमें से प्रत्येक एक दैहिक बाहर टिप सेल (डीटीसी) है कि एक विभेदित राज्य3,4में बाहर रोगाणु कोशिकाओं का कहना है कि घरों । इन रोगाणु कोशिकाओं के रूप में वे डीटीसी से दूर ले जाने के अंतर शुरू, इसके प्रभाव से बचने, और अंडाणुओं और शुक्राणु बन के रूप में वे germline के समीपस्थ अंत तक पहुँचने । इस प्रक्रिया के दौरान, रोगाणु कोशिका नाभिक, अर्धसूत्रीविभाजन5,6के लिए संक्रमण से पहले बँटवारा से गुजरना । शुक्राणु उत्पादन लार्वा चरण 4 (L4) के विकास के द्वारा पूरा हो गया है, जिसके बाद अंडाणुओं वयस्कता के दौरान उत्पादित कर रहे हैं । शुक्राणु spermatheca में संग्रहित होते हैं जहां वे भ्रूण उत्पन्न करने के लिए अंडाणुओं की खाद बनाते हैं ।
वहां कई आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि नाभिक की संख्या में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप सी एलिगेंस में germline विकास को प्रभावित कर सकते हैं, अपोप्तोटिक घटनाओं की संख्या, गुणसूत्र गतिशीलता, और प्रोटीन अभिव्यक्ति और/ ,8,9,10,11. इन घटनाओं के विश्लेषण परमाणु आकृति विज्ञान और वितरण के आधार पर भेदभाव के प्रत्येक चरण की पहचान की आवश्यकता है । सही ढंग से इन मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए एक बड़े नमूना आकार के साथ श्रम-प्रधान और समय लेने वाली है । इन कमियों को दरकिनार करने और विश्लेषण की निरंतरता को सक्षम करने के लिए, हमने नाभिक काउंटिंग, नाभिक वितरण, प्रोटीन एक्सप्रेशन, और cytoskeletal के लिए C. एलिगेंस germline की तीन आयामी परीक्षा के लिए एक स्वचालित विधि विकसित की संरचना. तीन आयामी प्रतिपादन के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन से, हम रोगाणु कोशिका विभेद के प्रत्येक चरण की पहचान के लिए आकार और आकार मापदंडों उत्पन्न । इसके अलावा, इस विधि रोगाणु कोशिका नाभिक और शुक्राणु प्लस प्रत्येक oocyte में गुणसूत्र संख्या के स्कोरिंग की गिनती में सक्षम बनाता है ।
germline में एक महत्वपूर्ण संरचना cytoskeleton है, जो germline डिब्बे को स्थिरता प्रदान करता है, एड्स cytoplasmic स्ट्रीमिंग और germline नाभिक12को संरक्षण । गणना प्रतिपादन का उपयोग करना, हम germline cytoskeleton के तीन आयामी पुनर्निर्माण प्रदर्शन किया और germline के भीतर विशिष्ट cytoskeletal सुविधाओं की पहचान की. यहां, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्णन करने के लिए कैसे गणना फोकल इमेजिंग के साथ संयुक्त विश्लेषण की व्याख्या सी. एलिगेंस germline के व्यापक विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।
हम C. एलिगेंस germline (चित्रा 1) के तीन आयामी विश्लेषण के लिए एक तीव्र विधि का प्रस्ताव है । तीन आयामी विश्लेषण का उपयोग करना, यह germline नाभिक के तीन आयामी वितरण का अध्ययन करने के लिए संभव है (चित्रा 2 और चित्रा 3), कोशिकाओं की स्वचालित गिनती (चित्रा 2), germline cytoskeleton के पुनर्निर्माण ( चित्रा 3), प्रोटीन का वितरण (चित्रा 4), और अंडाणुओं में spermatheca और गुणसूत्रों में शुक्राणु की संख्या स्कोरिंग (चित्रा 5). विधि न केवल germline के आसान और सटीक ठहराव सक्षम बनाता है, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक phenotypes की पहचान करता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) germline स्टेम सेल विकास, apoptosis, और गुणसूत्र गतिशीलता सहित कई जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जबकि germline एक उत्कृष्ट मॉडल है, विश्लेषण अक्सर दो समय और तीन आयामी विश्लेषण के लिए आवश्यक परिश्रम के कारण आयामी है । ऐसे अध्ययनों में प्रमुख readouts germline के भीतर नाभिक और प्रोटीन वितरण की संख्या/ यहां, हम germline के प्रत्येक क्षेत्र में संख्या और नाभिक की स्थिति निर्धारित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी और गणनात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर germline के स्वचालित विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । हमारे विधि भी germline प्रोटीन वितरण कि विभिंन आनुवंशिक पृष्ठभूमि में प्रोटीन अभिव्यक्ति के तीन आयामी परीक्षा में सक्षम बनाता है विश्लेषण करती है । इसके अलावा, हमारे अध्ययन germline है कि विशिष्ट स्थानिक विकास आवश्यकताओं को समायोजित कर सकते है के विभिंन क्षेत्रों में cytoskeletal वास्तुकला में बदलाव से पता चलता है । अंत में, हमारे विधि प्रत्येक germline के spermatheca में शुक्राणु की स्वचालित गिनती सक्षम बनाता है । एक साथ लिया, हमारी विधि में सक्षम बनाता है तेजी से और reproducible के phenotypic विश्लेषण C. एलिगेंस germline ।

आरेख 1 तीन-आयामी germline विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को इंगित करता है । L4 hermaphrodites 20 डिग्री सेल्सियस पर germlines को अलग करने के लिए और DAPI, phalloidin, और germline प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग विच्छेदित ...

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

हम Caenorhabditis एलिगेंस germline के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए एक स्वचालित विधि प्रस्तुत करतेहैं । हमारे विधि germline और विश्लेषण germline प्रोटीन वितरण और cytoskeletal संरचना के भीतर प्रत्येक नाभिक की संख्या और स्थिति निर्धारित करता है ।

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

The overall goal of this method is to automate the analysis of a Caenorhabditis elegans germline to study its nuclei, protein, and cytoskeletal distribution. This method can help answer the key questions in the C.Elegans field about the number of nuclei and sperm, nuclear distribution, and cytoskeletal structure of the germline. The main advantages of this technique are it reduces the analysis time, increases the sample size, and eliminate the human error associated with the manual analysis.To image the samples, place slides with stained germlines into the slide holder above the 63X objective of a confocal microscope, and locate a germline. Focus on the top of the germline, and mark it with the confocal microscope software. When the total germline thickness has been established, define the thickness of each slice up to 0.5 micrometers, and mark the complete germline.Then, start the acquisition, scanning each slice eight times and averaging the values to improve the image quality. When all of the images have been obtained, import the images to an appropriate image analysis software program, and use the surface function tool to select the mitotic region. An image of the distal end of the germline will appear.Cancel the automatic surface creation wizard, and manually draw a region of interest around the mitotic region at the first and last slices of the image from the three-dimensional stack. Click Create Surface, followed by Mask Channel, to mask all of the channels except the DAPI channel. Using the spot function tool, define the size parameters of the mitotic region with an XY diameter of two micrometers and with the Z diameter undefined.Click subtract background to subtract the background. To define the minimum threshold, increase the minimum 3D rendering threshold on a DAPI-stained wild-type germline until the first spot appears outside of the germline, and generate a 3D model for each region. After saving the images, click table to view the number of nuclei, as generated automatically by the software, and export the images as TIFF files.For the transition zone, create surface as explained before. Then, click Mask Channel to mask all the channels except the DAPI channel. Using spot function, define an XY diameter of two micrometers and Z diameter of 1.5 micrometers, and click subtract background to subtract the background.To define the minimum threshold, increase the minimum 3D rendering threshold on a DAPI-stained wild-type germline until the first spot appears outside of the germline, and generate a 3D model for each region. After saving the images, click table to view the number of nuclei, as generated automatically by the software, and export the images as TIFF files. For scoring the sperm number, select the spermatheca as the region of interest, as demonstrated for the nuclei regions, and use the spot function tool to define the XY diameter between 0.75 and one micrometers with an undefined Z diameter to detect each sperm.Select the Background Subtract box, and use the background correction values calculated by the software to subtract the background. Then, adjust the 3D rendering threshold to detect all of the DAPI-stained sperm in the spermatheca. For chromosome counting in the oocytes, select the oocytes and define the XY diameter as less than 0.75 micrometers, and define the threshold before developing the 3D models.Then, save the images for export as TIFF files. For cytoskeletal germline reconstruction, identify the mitotic region of interest in the germline and create a surface mask as previously demonstrated. Click Mask Channels to mask all of the channels except the phalloidin channel, and use the surface function tool to define a surface detail of 0.25 micrometers.After subtracting the background, adjust the 3D rendering threshold to save the developed 3D image for export as a TIFF file. The nuclei distribution is dependent on the stage of differentiation. For example, at the mitotic region, the inner actin appears as a solid mass upon which the nuclei are organized.In a wild-type germline, the mitotic region contains approximately 250 nuclei and is tightly packed with nuclei compared to the rest of the germline. As the nuclei move away from the distal end, however, they appear closer to the circumference of the germline, with the change in distribution starting at the transition zone and finishing as the nuclei enter the third stage of prophase in meiosis. At the transition zone, the germline inner actin assumes a more cylindrical structure, becoming a hollow cylinder as it reaches the pachytene.The second layer of actin covers the inner layer, giving shape to the germline. This cylinder within a cylinder actin structure disappears toward the oocyte region, at which point the actin appears as thick fibers covering the oocytes. In the spermatheca, the actin also forms into thick bundles of fiber, although these fibers appear to be packed more closely together than in the oocyte region.Three-dimensional rendering of the proximal end of the germline, as demonstrated, reveals an average of 151 sperm in each spermatheca. Once mastered, this analysis can be completed in 10 minutes per germline. While attempting this procedure, it is important to remember to define the analysis parameters according to the magnification of the objective used to visualize the germline in your experiment.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform an automatic analysis of a germline and to study cytoskeletal structure and to score the number of the nuclei within the germline.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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