Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل بمنحه نيجمس P50GM107618. يشكر المؤلفون زوهار باء اينشتاين للتعليقات الثاقبة والاقتراحات على المخطوطة.

ملاحظة: يمكن استخدام أي جزيء الصغيرة التي تثبط نمو البكتيريا كولاي لأسلوب قطري. في هذا البروتوكول، levofloxacin (ليف)، سيستخدم حمض الناليديكسيك (NAL)، والبنسلين G (PNG) على سبيل مثال، منذ هذه الأدوية إظهار تآزر الثلاثية بارزة. سير العمل لهذا البروتوكول هو موضح الشكل 6. القيام بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. استخدام الطازجة مختبرين للبكتيريا والمخدرات كل يوم. إجراء التجربة ضمن مستويات السلامة الملائمة كولاي.
1-إعداد الخطوات
<ol><li>تحضير الوسائط بيرتاني لوريا (رطل) بإضافة 25 جرام حساء رطل إلى 1 لتر ماء المقطر ويخلط. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتخزين الوسائط يعقم في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد الأرصدة والغليسيرول كولاي عن طريق خلط كميات متساوية من العقيمة 50% والغليسيرول والخلايا البكتيرية المخفف للتطوير التنظيمي600 = 1 في مرق رطل وتجميد 150 ميليلتر مختبرين في 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>حل 20 ملغ من المضادات الحيوية، وليف، نال وبابوا نيو غينيا في 1 مل سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) كل. تمييع الحل ليف x 100 إلى 0.2 ميكروغرام/مل بخلط 10 ميليلتر ليف الحل مع ميليلتر 990 من [دمس]. استخدام 0.2 مغ/مل ليف، و 20 ملغ/مل نال وبابوا نيو غينيا في خطوات المتابعة.</li>
	<li>الكوة ميليلتر 50 من كل المضادات الحيوية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب والتجميد في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>تأخذ واحد 150 ميليلتر قاسمة كولاي من-80 درجة مئوية. ذوبان الجليد.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر كولاي والغليسيرول المخزون في 5 مل الإعلام رطل في أنبوب ثقافة 14 مل.</li>
	<li>هز الأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 200 لفة في الدقيقة.</li>
</ol>2-مسلسل إضعاف الجرعة والاستجابة التجربة
<ol><li>تأخذ قاسمة أحد المخدرات ليف، نال وبابوا نيو غينيا من-20 درجة مئوية، وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لذوبان الجليد والتحضير لتخفيف المسلسل من هذه الأدوية.</li>
	<li>إعداد ميليلتر 1100 رطل-10% سول بخلط ميليلتر 990 رطلا وسائل الإعلام و 110 ميليلتر من المذيبات ([دمس]).</li>
	<li>إعداد 500 ميليلتر ليف رطل-10% عن طريق خلط ميليلتر 450 رطل وسائل الإعلام و 50 ميليلتر من ليف.</li>
	<li>دوامة رطل-10% سول 5 s في وضع أعلى. إضافة 20 ميليلتر من سول رطل-10% للصفوف الأربعة الأولى من الآبار في ميكروسكوبية 96-جيدا.</li>
	<li>دوامة ليف رطل-10% ل 5 s في وضع أعلى. إضافة 20 ميليلتر ليف رطل-10% إلى البئر الأولى في صف أ</li>
	<li>إعداد تمييع المسلسل شقين لليف رطل-10% عن طريق اتخاذ 20 ميليلتر من البئر الأولى، إضافة إلى البئر الثانية، بيبيتينج صعودا وهبوطاً خمس مرات. كرر هذه العملية لجميع الآبار تسلسلياً حتى الحادي عشر، الذي ينتهي مع 40 ميكروليتر (الشكل 7 أ).</li>
	<li>إزالة وتجاهل 20 ميليلتر للمحتوى من الحادي عشر أيضا، استخدام ميكروبيبيتي.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.3-2.7 للمخدرات نال و PNG باستخدام صفوف الميكروسكوبية، الثاني والثالث على التوالي.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.3-2.7 للمخدرات ليف مرة أخرى في الصف الرابع كعنصر إيجابي داخلية.</li>
	<li>باستخدام جهاز المطياف الضوئي، قياس OD600 من 01:10 إضعاف الثقافة (الخطوات 1، 1، 5-7).</li>
	<li>تمييع الخلايا في 5 مل الإعلام رطل ل التطوير التنظيمي600 من 0.01. تصب في خزان.</li>
	<li>استخدام ميكروبيبيتي متعددة القنوات، إضافة ميليلتر 80 من الخلايا المخفف لتخفيف المسلسل المخدرات إعدادها في الخطوة 2، 4-2.9. وتركيزات المخدرات النهائي في كل بئر يرد في الشكل 7 ألف. إغلاق لوحة لمنع التبخر.</li>
	<li>احتضان لوحة ح 16 عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>بدء ثقافة جرثومية جديدة لاستخدامها في الخطوة 3 (كرر الخطوات 1.5-1.7).</li>
</ol>3-خطية تمييع الاستجابة للجرعة التجربة
<ol><li>قياس امتصاص600 التطوير التنظيمي لتمييع المسلسل الاستجابة للجرعة لوحة من الخطوة 2 باستخدام قارئ لوحة (7A الرقم الصحيح) وتفسير النتائج استناداً إلى الخطوات التالية.</li>
	<li>تطبيع النمو عن طريق تقسيم النمو في كل بئر ومع النمو في مكافحة المخدرات لا لكل صف وحساب نسبة النمو بتطبيع OD600إلى أي شرط المخدرات.</li>
	<li>لكل دواء، قم بتحديد موقع الآبار التي لديها إعاقة النمو ~ 50% (IC50)، سيظهر اللون البرتقالي في الشكل 7 ألف الحق. قم بتعيين التركيز في هذه الآبار ك "IC50 المسلسل" لكل دواء.</li>
	<li>ذوبان الجليد مختبرين المخدرات الطازجة، وإعداد 1 مل سول رطل-10% عن طريق خلط الوسائط رطل والمذيبات ([دمس]) بنسبة 9:1 والمخدرات رطل-10% بخلط الوسائط رطل والمخدرات بنسبة 9:1، حيث التركيز على المخدرات هو x 100 ل IC50 كل دواء المسلسل قبل إضافة وسائط الإعلام رطل ، حسب اختياره في الخطوة 3، 3.</li>
	<li>إعداد خطيا زيادة جرعة من المخدرات ليف، نال وبابوا نيو غينيا في تركيزات 11، عن طريق خلط المخدرات رطل-10% وسول رطل-10% في الكميات المبينة في الشكل 7B.</li>
	<li>إعداد جرعات متزايدة خطيا لليف في الصف الرابع كعنصر إيجابي داخلية.</li>
	<li>قياس القطر الخارجي600 من 01:10 إضعاف الثقافة بدأت في الخطوة 2، 14.</li>
	<li>تمييع الخلايا في 5 مل الإعلام رطل ل التطوير التنظيمي600 من 0.01. تصب في خزان.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 80 من الخلايا المخفف إلى تخفيف الخطي المخدرات أعد الخطوة 3.6 استخدام ميكروبيبيتي متعدد القنوات. ويبين 7B الشكلتركيزات المخدرات النهائي في كل بئر. ملاحظة: سوف تتلقى الأوسط جيدا في الاستجابة للجرعة IC50 التسلسلي لهذه المخدرات. ختم اللوحة لمنع التبخر.</li>
	<li>احتضان لوحة ح 16 عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>بدء ثقافتين بكتيرية جديدة لاستخدامها في الخطوة 4 (كرر الخطوات 1.5-1.7).</li>
</ol>4-تجربة التفاعل المخدرات قطري
<ol><li>قياس امتصاص600 التطوير التنظيمي للاستجابة للجرعة تمييع الخطي من الخطوة 3 (الشكل 7).</li>
	<li>لكل دواء، اختر تركيز أدت إلى IC50 وتحضير المخدرات ليف، نال وبابوا نيو غينيا في تركيزات x IC50 100.</li>
	<li>ذوبان الجليد العقاقير الجديدة، وإعداد 100 x IC50 لكل المخدرات وإعداد الخلائط المخدرات 1:1 بالحجم ليف + المختبر وليف + PNG ونال + PNG و 1: خليط المخدرات 1:1 من حيث الحجم ليف + NAL + بابوا نيو غينيا.</li>
	<li>إعداد لوحات اثنين للمخدرات تجارب التفاعل كما هو مبين في الشكل 8.</li>
	<li>قياس القطر الخارجي600 من 01:10 إضعاف الثقافات بدأت في الخطوة 3.11.</li>
	<li>إعداد OD600 = 0.01 تخفيف الثقافات اثنين في اثنين من 10 مل من الإعلام رطل.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 80 من الخلايا من الثقافة 1 و 2 على ألواح 1 و 2، على التوالي. ختم لوحات لمنع التبخر. احتضان لوحات ح 16 عند 37 درجة مئوية.</li>
</ol>5-قطري المخدرات التفاعل عشرات
<ol><li>تجربة قياس امتصاص600 التطوير التنظيمي للتفاعل المخدرات قطري لوحات من الخطوة 4.</li>
	<li>تطبيع النمو بتقسيم النمو في كل بئر ومع النمو في مكافحة المخدرات ليس جيدا لكل صف.</li>
	<li>لكل صف، حدد العمود الذي يحتوي على تثبيط النمو الأقرب إلى IC50، تظهر باللون البرتقالي في الشكل 8 الحق. تعيين IC50 استناداً إلى التركيز النسبي للمخدرات في هذا جيدا.</li>
	<li>ليف + المختبر وليف + PNG واستجابات الجرعة نال + PNG وليف + NAL + PNG، حساب IC50 المتوقع بحساب متوسط IC50 الأدوية واحد في كل مجموعة. نلاحظ أن المتوسط تقريب بسيطة لحساب IC50 المتوقع المحدد كما هو موضح قبل12.</li>
	<li>حساب عشرات تركيز المثبطة كسرية (FIC) بتقسيم IC50 الملحوظة التي IC50 المتوقعة في كل مجموعة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يتم استخدام تركيبات العقاقير ضد مسببات الأمراض أو الأورام احتمال جذابة، ولا سيما في ظل هذه الظروف خط أنابيب التجفيف المضادات الحيوية. ومع ذلك، هذه الإمكانات تعيقه الصعوبات اثنين على الأقل. الصعوبة الأولى هي الفلكية عدد التركيبات الممكنة. وهناك، على سبيل المثال، 4950 التركيبات العشوائية الممكنة بين 100 من المضادات الحيوية. كافة التركيبات الممكنة بين 100 المضادات الحيوية (2100) هو على نفس ترتيب الحجم مع العدد من البكتيريا على الأرض (~ 1030). كيفية التنبؤ بتركيبات بشدة التآزر فيما بين هذه الإمكانيات كانت موضوع العديد من الدراسات الحاسوبية. الصعوبة الثانية هي قياس التفاعلات المخدرات ذات الترتيب العالي. نعتبر أن منصة حسابية قد توحي بأن تركيبة معينة 10-المخدرات التآزر بقوة ضد ممرض معينة. الطرق التقليدية لاختبار المخدرات التفاعلات مكلف جداً التحقق من صحة أو دحض هذا الافتراض، ولذلك تم دراسة التفاعل بين العديد من الأدوية خارج الحدود للبحث العلمي. الأسلوب قطري، الذي كان أول من اقترح قبل 30 عاماً تقريبا، وكان يستخدم في بعض الشاشات التآزر الأخيرة توفر أساسا قويا للمشكلة الأولى، بالسماح باختبار التفاعل بين العديد من أزواج. فإنه يحل المشكلة الثانية بأخذ عينات الزاخر بمعلومات لفحوصات التقليدية ويتيح دراسة التفاعلات المخدرات ذات الترتيب العالي.
الأهم من ذلك أننا نلاحظ أن لدينا بروتوكول يستخدم الجرعات الخطية للمخدرات التفاعل القياسات، بما يوفر حساسية للكشف عن التفاعلات الضعيفة حتى. إنشاء نطاق التركيز الصحيح للجرعات الخطية مهمة صعبة. بأول أداء إضعاف مسلسل، يمكننا اتخاذ قرار مستنير حول مساحة البحث للجرعات الخطية. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول لاستخدام 2-fold أو تخفيف المسلسل أعلى للمخدرات اختبار التفاعل. مثل هذا تعديل سوف تقصير وقت التجربة والسماح بإجراء التجارب على مزيد من التفاعلات؛ ومع ذلك، سيتعين عليها حساسية للكشف عن التفاعلات فقط بشدة التآزر أو معادية.
ويبين البروتوكول وصفناها قياس التفاعلات العشوائية أو ثلاثية. أحد جوانب حاسمة للبروتوكول أن وكلاء واحد على اللوحة نفسها كمجموعة، للتقليل من التحيز بسبب الاختلافات لوحة. ولذلك، يمكن تعديل البروتوكول لقياس التفاعلات حتى 7-طريقة مجموعات بتعديلات تافهة. تركيبات من العقاقير أكثر من 7 سيتطلب أكثر من 96-جيدا الميكروسكوبية والاعتبارات الإضافية الواجب اتخاذها لضمان تكامل البيانات الصحيحة، مثل replicates داخلي بين.
حد ملحوظ من الأسلوب قطري هو التقييد أن كل دواء في الفحص يجب أن تمنع النمط الظاهري للفائدة. ولذلك، الأسلوب قطري ليست مفيدة لفهم التفاعلات بين عناصر فاعلة والمواد الخاملة. وقد درس هذه التفاعلات 'قد' تحت نماذج بديلة مثل نماذج بليس أو عامل واحد أعلى.
أحد الاعتبارات هامة للتحليل التفاعلات المخدرات ذات الترتيب العالي هو اختيار نموذج فارغ "يتوقع IC50". عندما يتم الجمع بين اثنين من المخدرات، يمكن تأثير أن الجمع بين مقارنة بآثار المخدرات واحد فقط. عندما يتم الجمع بين ثلاثة أدوية، يمكن مقارنة أثر التركيبة إلى آثار واحدة أو آثار عشوائية. على سبيل المثال، إذا كانت كافة تركيبات عشوائية من ثلاثة عقاقير تآزرية، ثم يمكن توقع أن هذه الأدوية سوف تظهر تعاونا ثلاثيا. تفاعل ثلاثية بالانحراف عن ما هو متوقع من التفاعلات العشوائية مؤخرا سميت "التفاعل الناشئة"16،17. للبساطة، ويصف لنا بروتوكول قياس "صافي التفاعل ثلاثية تركيبة،" الذي يحدد نموذج فارغ كآثار المخدرات واحد. ومع ذلك، البيانات التي يتم الحصول عليها من البروتوكول قد تستعمل أيضا لحساب التفاعل الناشئة من تركيبة ثلاثية. في تحليلنا، حددنا IC50 المتوقعة من تركيبة ثلاثية كمتوسط للمخدرات واحد IC50s. وبدلاً من ذلك، يمكن تعريف IC50 المتوقعة كمتوسط IC50s تركيبات عشوائية (~1.1-1.2). عندما ينقسم IC50 الملحوظ بهذا البديل IC50 المتوقعة، يوفر FIC المتحصل عليها FIC الناشئة للجمع بين الثلاثية، كما هو موضح سابقا12. هذا الاعتبار يكشف أن ليف + NAL + PNG تعاوني أكثر من ما يمكن توقعه من التفاعلات اقتران بين ثلاثة أدوية، مما يدل على أن ليف + NAL + بابوا نيو غينيا قد التآزر الناشئة.

قد يحمل تركيبات المخدرات تأثير عالية أو منخفضة من المستغرب على النمط الظاهري نظراً لآثار المخدرات التأسيسية، المقابلة للتفاعلات المخدرات التآزر أو معادية،1،2،على التوالي3. قد تسمح استخدام تركيبات التآزري تصعيد الجرعة لزيادة الفعالية وتخفيض الجرعة للتخفيف من الآثار الجانبية. كما يجوز تطبيق العلاجات تركيبة نكسات متعددة للأجهزة الخلوية، وبالتالي عرقلة آليات الهروب التطورية المحتملة للمقاومة4. ولذلك، تستخدم مجموعات من ثلاثة أو أكثر من المخدرات بشكل روتيني في معاملة الممرض أو السرطان5.
يتم تعريف التآزر والعداء بإجراء مقارنة بين التأثير الملاحظ لتركيبة مقابل تأثير المتوقعة نظراً لتأثيرات العقاقير فردية. بين النماذج للتفاعلات المخدرات، الجمع Loewe هو الأكثر صرامة، ونموذج فارغ المعالم (رقم 1)6، ومستقل عن تركيز المخدرات تستخدم التفاعل المستدل التآزر/العداء 6 , 7-إلا أن نموذج Loewe مكلف تجريبيا حتى بالنسبة لاختبار تفاعل عشوائية. المخدرات التفاعل فحوصات عادة تتألف من مصفوفة ثنائية الأبعاد من مجموعات تركيز المخدرات (مقايسة شطرنج) (2 الرقم). إذا يتم استخدام جرعات 5 لكل دواء، ثم تركيبات 25 مطلوبة، المقابلة لأحد النصف من الميكروسكوبية إذا أجريت تجارب في تكرار. تكلفة هذا النهج يمنع قياس التآزر بنموذج الجمع Loewe لتركيبات الأدوية المتعددة (الرقم 3). على سبيل المثال، لاختبار وجود تفاعل 10-الطريقة، سيتطلب الطرق التقليدية ميكروبلاتيس أكثر من 100 ألف، يمنع القياس التجريبي للتآزر ذات الترتيب العالي بصرامة واعتماداً جيدا ومستقلة عن تركيز النموذج الجمع Loewe 8.
استخدام العلاجات السريرية الحالية سوى جزء صغير من تركيبات العقاقير الممكنة. على سبيل المثال، قياسي علاج مرض السل النشط مزيج من المضادات الحيوية الثلاثة. وهناك حوالي 20 المضادات الحيوية المستخدمة في علاج بكتريا السل (Mtb). وهناك 1140 تركيبات 3-طريقة ممكنة بين 20 عقارا، كل منها يمكن أن يكون هو تضافر قوي ضد المواضيع المتميزة. كما كانت هناك لا طريقة فعالة من حيث التكلفة لقياس المخدرات التفاعلات فيما بين العديد من الأدوية، تظل تركيبات التآزر المحتمل المنقذة للحياة التي لم تختبر.
وهنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لقياس التفاعلات المخدرات العشوائية والثلاثية بأخذ العينات فقط قطري من لوح شطرنج الإنزيم (الرقم 4 و الرقم 5). والمفهوم الأساسي لأخذ العينات قطري من تجربة لوح شطرنج كان اقتنع قبل بيرنبوم في عمله البارز في عام 19789. حتى الآن، إلا في الآونة الأخيرة وتم تطبيق هذا النهج على المخدرات التآزر شاشات10،،من1112. نقدم لدينا بروتوكول مع الإشريكيّة القولونية (كولاي) والنمط الظاهري النمو. بيد أننا نلاحظ أن البروتوكول هو مستقلة عن الأنواع البيولوجية والنمط الظاهري للفائدة، وبالتالي يمكن تطبيقها على قياس التآزر المخدرات ذات الترتيب العالي في سياقات أخرى بيولوجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

وقد مزيج العقاقير تآزر كفاءة أعلى مقارنة بآثار المخدرات فرادى. فحوصات رقعة الداما، حيث يتم الجمع بين العقاقير بجرعات كثيرة، تسمح بقياس حساسة للتفاعلات المخدرات. ومع ذلك، هذه فحوصات مكلفة وغير مقياس جيد لقياس التفاعل بين العديد من الأدوية. وأفادت الدراسات الأخيرة عدة المخدرات التفاعل القياسات باستخدام عينة قطري لفحص رقعة الداما التقليدية. هذه المنهجية البديلة يقلل تكلفة تجارب التفاعل المخدرات إلى حد كبير ويتيح قياس التفاعل لتركيبات مع العديد من الأدوية. هنا، يصف لنا بروتوكولا لقياس التفاعلات العشوائية ثلاثة وواحد ثلاثة طريقة التفاعل بين المضادات الحيوية الثلاثة في التكرارات، في خمسة أيام، باستخدام ثلاثة فقط ميكروبلاتيس 96-جيدا ومعدات المختبرات القياسية. نقدم الممثل النتائج تبين أن الجمع بين ثلاثة-المضادات الحيوية البنسلين G + Levofloxacin + حمض الناليديكسيك تآزرية. لدينا بروتوكول جداول لقياس التفاعل بين العديد من الأدوية، وفي سياقات أخرى بيولوجية، مما يسمح لشاشات فعالة للأدوية المتعددة التآزر ضد مسببات الأمراض والأورام.

سابقا، لقد أبلغ التفاعلات اقتران بين ثلاثة أدوية: ليف، نال وبابوا نيو غينيا استناداً إلى التجارب في فحوصات الشطرنج المنمنمة، حيث تم الجمع بين اثنين من المخدرات في مصفوفة 4 x 413،14. بينما التآزري المختبر وليف، أفيد أن تكون معادية مع13،ليف ونال14بابوا نيو غينيا. هنا، يمكننا التحقق من هذه التفاعلات العشوائية وقياس التفاعل ثلاثي بين هذه الأدوية الثلاثة باستخدام مقايسة قطري. أن تثبت النتائج التي توصلنا إليها ليف + NAL + PNG مجموعة المضادات الحيوية 3-طريقة تآزرية. وأعطيت التمثيل التخطيطي للنتائج في المقاطع الفردية الإجراءات التجريبية في الجانب الأيمن من الشكل 7 و الرقم 8. نقدم هنا، وتفسير النتائج الخام الممثل من ثلاث قراءات اللوحة، التي ترد في الشكل 9. قراءة اللوحة العلوية يناظر تجارب تمييع المسلسل والخطي في الخطوتين 2 و 3. أسفل لوحة قراءتين لوحات التفاعل مكررة في الخطوة 4.
البيانات الخام في الشكل 9 يوضح أن النمو الأعلى حول 0.55، لكن هناك بكثافة بصرية 0.05 من وسائل الإعلام نفسها، كما لوحظ في التطوير التنظيمي600 من تركيزات عالية من المخدرات حيث لا يوجد أي نمو. ولذلك، علينا أن نحدد IC50 ك (0.55-0.05)/2 = 0.25. لكل الجرعة والاستجابة، ترد الآبار الموقع الأقرب إلى هذه القيمة مع اللون البرتقالي.
النصف العلوي من الشكل 9 ألف يبين النتائج من الخطوة 2، تجربة المسلسل الجرعة والاستجابة. الآبار IC50 لليف في العمود 10 في اثنين replicates، التي تتوافق مع 4 نانوغرام/مليلتر. IC50 للمختبر وبابوا غينيا الجديدة في 3 ميكروغرام/ملليلتر و 25 ميكروغرام/مل، على التوالي. وتقابل هذه التركيزات التركيز 1 x الموضح في الشكل 7B. النصف السفلي من الشكل 9B يبين النتائج من الخطوة 3، تجارب الخطية الجرعة والاستجابة. ليف، ونال و IC50 في بابوا غينيا الجديدة توجد في 0.4 x, 0.8 x و 1.2 x، على التوالي. يتم تعيين هذه التركيزات ك 1 X IC50 للخطوة 4.
تظهر لوحات اثنين المقابلة لاثنين تكرار تجارب مبينة في الشكل 9B، حيث الآبار IC50 مع اللون البرتقالي. في لوحة 1، جميع الأدوية مفردة لها بهم IC50 بتركيز 1 x. IC50 المتوقعة لتركيبة عشوائية أو ثلاثية يحسب بالوسط الحسابي للأدوية المكونة لها، مما يجعل IC50 المتوقعة لجميع تركيبات x 1 أيضا تركيز. في لوحة 2، ليف و PNG IC50 بهم في تركيز 1 x، ولكن IC50 المختبر في 1.2 x. IC50 المتوقعة لكل مجموعة يتم تعريفه باستخدام الوسائل الحسابية لهذه القيم IC50. على سبيل المثال، IC50 المتوقعة لليف + المختبر والمختبر + PNG هو 1.1 x. نقاط التفاعل المخدرات (FIC) لكل تركيبة يحسب بقسمة لاحظ IC50 مع IC50 المتوقعة، كما هو مبين في الجانب الأيمن من اللوحات. تفتيش عشرات FIC لوحات اثنين تثبت أن ليف + المختبر وليف + NAL + PNG تآزرية، بينما ليف + PNG ونال + PNG معادية. FIC الدرجات التي تم الحصول عليها في لوحات اثنين في الاتفاق، دعم موثوقية البروتوكول.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> رقم 1: Null التعريف النموذجي لنموذج التفاعل المخدرات الجمع Loewe. المصفوفات هما 5 × 5 على ميكروسكوبية، المخدرات بزيادة خطيا في محور واحد كما هو موضح في اليسار، حيث يمنع بتركيز أعلى من المخدرات النمط الظاهري القابلة للقياس الكمي (أعلى اليمين). ويرد إضافة هذه المصفوفات في الوسط، حيث خطوط الاتصال اكويبوتينت المخدرات تركيزات في كل دواء واحد يكون تركيز نفسه كالمخدرات ألف عندما تتم إضافة الخلايا في هذه "اللوحة" من مجموعات تركيز المخدرات، ومن المتوقع أن النمط الظاهري مسجل على هذا الخط سيكون معادلاً للآبار فإنه يتصل. في هذه التجربة المتمتعة بالحكم الذاتي-الذاتي المخدرات التفاعل، يتوقع إيسوبولي يصور النمط الظاهري (تظهر بخط أخضر متقطع) الخطية، تعريف النموذج فارغة الجمع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> رقم 2: التفاعلات المخدرات العشوائية وفقا لنموذج التفاعل المخدرات الجمع Loewe. عندما يتم الجمع بين اثنين من المخدرات في مقايسة شطرنج كما في الشكل 1، قد يكون كفاف إيسوفينوتيبيك ملاحظتها مباشرة أو محدب أو مقعر. على اليمين، معالم ممكن إيسوفينوتيبيك (خطوط أخضر متقطع) يتم فرضه على فحوصات رقعة الداما. تركيبات المخدرات مع ملامح إيسوفينوتيبيك على التوالي هي Loewe-مضافة، كالمعالم لا تختلف عن وجود تفاعل المخدرات الذاتي المتمتعة بالحكم الذاتي، وهو Loewe-مضافة بحكم التعريف. عندما كفاف إيسوفينوتيبيك إلى حد كبير مقعر أو محدب، التركيبة التآزر أو معادية، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> الشكل 3: التفاعلات المخدرات ثلاثية وفقا لنموذج التفاعل المخدرات الجمع Loewe. مشابهة لفحص رقعة الداما للتفاعلات العشوائية، ثلاثة-المخدرات هي جنبا إلى جنب في شبكة ثلاثية الأبعاد ("تشيكيركوبي")، حيث يتم زيادة كل المخدرات خطيا في محور واحد. إذا كانت ثلاثة عقاقير مماثلة، على سطح إيسوفينوتيبيك المتوقع أن تكون مسطحة، تعريف الجمع لثلاث مجموعات من المخدرات. إذا كان السطح مقعر أو محدب من هذا الطراز Loewe-مضافة فارغة أكثر، تركيبات المخدرات التآزر أو معادية، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> الشكل 4: أسلوب قطري لقياس التفاعلات المخدرات العشوائية. لكل فحص رقعة الداما، تقاس فقط في المناطق التي أظهرت في مستطيلات الأرجواني. الأول والثاني خطيا زيادة تركيزات المخدرات واحد. ويتم تقييم ثالثا بجعل خليط 1:1 من اثنين من العقاقير والمعايرة هذا الخليط خطيا كما لو كانت دواء واحد. FIC يتساوى IC50 الملاحظ في تركيبة مقسوماً على IC50 المتوقعة للمخدرات واحد اثنين. لنموذج الجمع Loewe، يتم تقريبها IC50 المتوقعة ب IC50 متوسط للمخدرات واحد اثنين. قيمة FIC 1 لأزواج Loewe-مضافة وهو أدنى أو أعلى من 1 لأزواج التآزر أو معادية، على التوالي2،12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> الرقم 5: أسلوب قطري لقياس التفاعلات المخدرات ثلاثية- لكل فحص تشيكيركوبي، يتم قياس المناطق سيظهر فقط. الأول، والثاني والثالث خطيا زيادة تركيزات المخدرات واحد. رابعا يقاس بصنع 1:1:1 خليط من ثلاثة عقاقير والمعايرة هذا الخليط خطيا كما لو كانت دواء واحد. تركيز المثبطة كسرى يساوي IC الملاحظة50 في الجمع بين مقسوماً على IC50 المتوقعة نظراً للمخدرات واحد ثلاثة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> رقم 6: سير عمل البروتوكول الأسلوب قطري الموضحة هنا وتفاصيل الإعداد لكل الميكروسكوبية. لوحة تظهر في 4 يوم يجري في مكررة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> رقم 7: تجارب الاستجابة للجرعة تمييع المسلسل والخطي- (أ) إعداد مسلسل إضعاف الجرعة والاستجابة للمخدرات واحد والمقابلة النهائية المخدرات تركيزات. كولاي خلايا يتم إضافتها إلى اللوحة؛ يتم تسجيل النمو بعد 16 h. IC50 التسلسلي، سيظهر في أورانج، محدداً لكل دواء لاستخدامها في اليوم التالي في خطي التجارب إضعاف الجرعة والاستجابة. (ب) إعداد خطي إضعاف الجرعة والاستجابة للمخدرات واحد والمقابلة النهائية المخدرات تركيزات. كولاي خلايا يتم إضافتها إلى اللوحة؛ ويقيد النمو بعد ح 16. لكل دواء، المخدرات IC50s المحددة التي سيتم استخدامها في اليوم التالي من حيث التفاعل وتظهر التجارب في أورانج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> الشكل 8: المخدرات تجارب التفاعل. يتم إعداد تجارب التفاعل مشابهة لواحدة المخدرات الخطي الجرعة-الردود، ما عدا أن 1 أو 1:1:1: 1 خليط من الأدوية يستخدم لمدة سنتين أو ثلاثة المخدرات جرعة-الردود، على التوالي. ولاحظ IC50s لكل الجرعة والاستجابة، صورت في أورانج، المستخدمة لحساب FIC العشرات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> الشكل 9: الممثل تجربة النتائج. ويرد الممثل النتائج المتحصل عليها باستخدام بروتوكول وصف، مع التفاصيل الواردة في النص الرئيسي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

أسلوب قطري لقياس التفاعل بين أي عدد من المخدرات

في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية جعل Loewe قياسات التفاعل المخدرات على أساس الجمع بيرويس وتركيبات العقاقير الثلاثية.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس الوظيفة المتقدرية سليمة من خلايا بيتا حضور المركبات الطبيعية

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...