Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NIGMS Grant P50GM107618. Forfatterne takke Zohar B. Weinstein indsigtsfulde kommentarer og forslag om håndskriftet.

Bemærk: Ethvert lille molekyle, der hæmmer E. coli bakterievækst kan bruges til metoden diagonal. I denne protokol, levofloxacin (LEV), vil nalidixic syre (NAL) og Penicillin G (PNG) blive brugt som eksempel, da disse stoffer viser en iøjnefaldende tre-vejs synergi. Arbejdsprocessen i denne protokol er vist som figur 6. Udføre alle trinene ved stuetemperatur. Bruge friske delprøver af bakterier og medicin hver dag. Udføre forsøget under biosikkerhed niveauer passende for E. coli.
1. forberedelse trin
<ol><li>Forbered Luria-Bertani (LB) medier ved at tilføje 25 g LB bouillon til 1 L destilleret vand og blandes. Autoklavering ved 121 ° C i 15 min og butik autoklaveres medierne ved stuetemperatur.</li>
	<li>Forberede E. coli glycerol bestandene ved at blande lige store mængder af sterile 50% glycerol og bakterieceller fortyndet til OD600 = 1 i LB bouillon og fryse 150 µL delprøver i 1,5 mL microcentrifuge rør ved-80 ° C.</li>
	<li>Opløse 20 mg af antibiotika, LEV, NAL og PNG i 1 mL af dimethylsulfoxid (DMSO) hver. Fortynd LEV løsning 100 x 0,2 µg/ml ved at blande 10 µL af LEV løsning med 990 µL af DMSO. Bruge 0,2 mg/mL LEV, og 20 mg/mL NAL og PNG i proceduren trin.</li>
	<li>Alikvot 50 µL af hver antibiotikum til 1,5 mL microcentrifuge rør og fryse ved-20 ° C.</li>
	<li>Tage et 150 µL alikvot af E. coli fra-80 ° C. Tø.</li>
	<li>Tilsæt 100 µL af E. coli glycerol lager i 5 mL af LB medier i en 14 mL kultur tube.</li>
	<li>Ryst rør i et 37 ° C inkubator overnatning på 200 rpm.</li>
</ol>2. seriel fortynding dosis-respons eksperiment
<ol><li>Tage en alikvot af narkotika LEV, NAL og PNG fra-20 ° C, lad dem ved stuetemperatur i 10 min at tø og forberede serielle fortyndinger af disse stoffer.</li>
	<li>Forberede 1100 µL af LB - 10% sol ved at blande 990 µL af LB medier og 110 µL opløsningsmiddel (DMSO).</li>
	<li>Forberede 500 µL af LB - 10% LEV ved at blande 450 µL af LB medier og 50 µL af LEV.</li>
	<li>Vortex LB - 10% sol for 5 s på højeste indstilling. Tilføj 20 µL af LB - 10% sol på de øverste fire rækker af brønde i en 96-brønd mikrotiterplade.</li>
	<li>Vortex LB - 10% LEV for 5 s på højeste indstilling. Tilføj 20 µL af LB - 10% LEV til den første brønd i rækken A.</li>
	<li>Laves dobbelt seriel fortynding for LB - 10% LEV ved at tage 20 µL fra de første godt, tilføjer til den anden brønd, pipettering op og ned fem gange. Gentag dette for alle brønde sekventielt indtil den 11 godt, der ender med 40 µL (figur 7A).</li>
	<li>Fjern og kassér 20 µL af indholdet fra 11., ved hjælp af en mikropipette.</li>
	<li>Gentag trin 2,3-2,7 for narkotika NAL og PNG med de anden og tredje rækker af mikrotiterplade, hhv.</li>
	<li>Gentag trin 2,3-2,7 for drug LEV igen på fjerde række som en indre positiv kontrol.</li>
	<li>Bruger et spektrofotometer, måle OD600 af en 1:10 fortynding af kultur (trin 1,5-1,7).</li>
	<li>Fortyndes cellerne i 5 mL af LB medier til en OD600 0,01. Hæld i et reservoir.</li>
	<li>Du bruger en multikanals mikropipette, tilføje 80 µL af de fortyndede celler til narkotika serielle fortyndinger forberedt i trin 2.4-2.9. De endelige drug koncentrationer i hver brønd er vist i figur 7A. Forsegle pladen for at undgå fordampning.</li>
	<li>Inkuber plade i 16 timer ved 37 ° C.</li>
	<li>Start en ny bakteriekulturen til brug i trin 3 (Gentag trin 1,5-1,7).</li>
</ol>3. lineær fortynding dosis-respons eksperiment
<ol><li>Absorbansen OD600 for seriel fortynding dosis-respons plade fra trin 2 ved hjælp af en Pladelæser (figur 7A højre) og fortolke resultaterne baseret på følgende trin.</li>
	<li>Normalisere væksten ved at dividere væksten i hver brønd med en vækst i den ingen narkotikakontrol for hver række og beregne procentvis vækst af normalisering OD600til ingen narkotika tilstand.</li>
	<li>For hver enkelt drug, finde de brønde, der har ~ 50% væksthæmning (IC50), vist i orange i figur 7A højre. Tildele koncentration i disse brønde som "serial IC50" for hvert stof.</li>
	<li>Tø frisk drug delprøver, forberede 1 mL af LB - 10% sol ved at blande LB medier og opløsningsmiddel (DMSO) i en 9:1 ratio og LB - 10% stof ved at blande LB medier og stof i forholdet 9:1, hvor det stof koncentration er 100 x for hver enkelt drug seriel IC50 før du tilføjer LB medier , som valgt på trin 3.3.</li>
	<li>Forberede lineært stigende doser af narkotika LEV, NAL og PNG i 11 koncentrationer, ved at blande LB - 10% stof og LB - 10% sol i mængder, der er vist i figur 7B.</li>
	<li>Forberede lineært stigende doser af LEV på fjerde række som en indre positiv kontrol.</li>
	<li>Måle OD600 1:10 fortynding af kultur begyndte i trin 2.14.</li>
	<li>Fortyndes cellerne i 5 mL af LB medier til en OD600 0,01. Hæld i et reservoir.</li>
	<li>Tilsættes 80 µL af de fortyndede celler til narkotika lineær Fortyndingerne forberedt i trin 3.6 bruger en multikanals mikropipette. De endelige drug koncentrationer i hver brønd er vist i figur 7B. Bemærk: Midten godt i dosis-respons vil modtage det serielle IC50 for dette stof. Forsegle pladen til at forhindre fordampning.</li>
	<li>Inkuber plade i 16 timer ved 37 ° C.</li>
	<li>Start to friske bakteriel kulturer til brug i trin 4 (Gentag trin 1,5-1,7).</li>
</ol>4. diagonal Drug interaktion eksperiment
<ol><li>Absorbansen OD600 for lineær fortynding dosis-respons fra trin 3 (figur 7B).</li>
	<li>Hver enkelt drug, vælge den koncentration, som resulterede i IC50 og forberede narkotika LEV, NAL og PNG i 100 x IC50 koncentrationer.</li>
	<li>Tø frisk narkotika, forberede 100 x IC50 for hvert stof og forberede 1:1 drug blandinger af volumen af LEV + NAL, LEV + PNG og NAL + PNG og 1:1:1 drug blanding af volumen af LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Forberede drug interaktion eksperimenter som vist i figur 8to plader.</li>
	<li>Måle OD600 1:10 fortynding kulturer startede i trin 3.11.</li>
	<li>Forberede OD600 = 0,01 fortyndinger af to kulturer i to 10 mL af LB medier.</li>
	<li>Tilføje 80 µL af celler fra kultur 1 og 2 på nummerplader 1 og 2, henholdsvis. Forsegle plader for at undgå fordampning. Inkuber plader i 16 timer ved 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonal Drug interaktion Scores
<ol><li>Foranstaltning OD600 Absorbansen for diagonal lægemiddelinteraktion eksperimentere plader fra trin 4.</li>
	<li>Normalisere væksten ved at dividere væksten i hver brønd med en vækst i den ingen narkotikakontrol godt for hver række.</li>
	<li>For hver række, Find den kolonne, der har væksthæmning tættest på IC50, vist i orange i figur 8 rigtige. Tildele IC50 baseret på den relative koncentration af stoffet i denne godt.</li>
	<li>LEV + NAL, LEV + PNG og NAL + PNG og LEV + NAL + PNG dosis-respons, beregne forventet IC50 ved gennemsnit IC50 for de enkelte lægemidler i hver kombination. Bemærk, at i gennemsnit er en simpel tilnærmelse til nøjagtig forventede IC50 beregning som beskrevet før12.</li>
	<li>Beregne fraktioneret hæmmende koncentration (FIC) noder ved at dividere den observerede IC50 af den forventede IC50 i hver kombination.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Brugen af narkotika kombinationer mod patogener eller tumorer er attraktivt, især under omstændighederne af tørring antibiotika rørledningen. Dette potentiale er imidlertid hæmmet af mindst to problemer. Den første vanskelighed er de astronomiske antal mulige kombinationer. Der er for eksempel 4950 parvise kombinationer blandt 100 antibiotika. Alle mulige kombinationer blandt 100 antibiotika (2100) er på den samme størrelsesorden med antallet af bakterier på jorden (~ 1030). Hvordan du forudsige kraftigt synergistiske kombinationer blandt disse muligheder har været genstand for talrige beregningsmæssige undersøgelser. Det andet problem er måling af høje lægemiddelinteraktioner. Mener, at en beregningsmæssige platform kan tyde på at en bestemt 10-drug kombination er stærkt synergistiske mod en bestemt patogen. Traditionelle metoder til at teste lægemiddelinteraktioner er for dyrt at bekræfte eller afkræfte denne hypotese, derfor undersøgelse af synergi blandt mange lægemidler har været uden for grænserne for videnskabelig undersøgelse. Metoden diagonal, som blev først foreslået næsten 30 år siden og blev brugt i et par nylige synergy skærme tilvejebringe et solidt fundament for det første problem, ved at tillade afprøvning af interaktion blandt mange par. Det løser det andet problem ved en informativ prøvetagning af de traditionelle assays og giver mulighed for undersøgelse af høj-ordre lægemiddelinteraktioner.
Vi Bemærk vigtigere, at vores protokol bruger en lineær dosering for drug interaktion målinger, for at give følsomhed til at afsløre selv svage interaktioner. Om oprettelse af de rigtige koncentrationsområde for lineær dosering er en udfordrende opgave. Ved først at udføre en seriel fortynding, træffe vi en informeret beslutning om søgning plads for lineær dosering. Men protokollen kan ændres til at bruge 2-fold eller højere serielle fortyndinger for drug interaktion test. Denne ændring vil forkorte tid, eksperiment og giver mulighed for afprøvning af flere interaktioner; Det ville dog have sensitivitet til at opdage kun stærkt synergistisk eller antagonistisk interaktion.
Protokollen beskrev vi, viser måling af parvise eller tre-vejs interaktioner. Et kritisk aspekt i protokollen er, at enkelt ansatte er på den samme plade som kombination, at minimere bias på grund af plade variationer. Derfor, protokollen kan justeres for at måle interaktioner op til 7-vejs kombinationer af trivielle ændringer. Kombinationer af mere end 7 narkotika vil kræve mere end én 96-brønd mikrotiterplade og yderligere overvejelser skal træffes for at sikre korrekte dataintegration, såsom indbyrdes plate replikater.
En bemærkelsesværdig begrænsning af metoden diagonal er den begrænsning, at hver enkelt drug i analysen skal hæmme Fænotypen af interesse. Derfor, metoden diagonal er ikke nyttigt for forståelse samspil mellem aktive agenter og inert adjuvanser. Sådanne 'potentiating' interaktioner kan studeres under alternative modeller såsom Bliss eller højeste enkelt Agent modeller.
En vigtig overvejelse for analysen af høj-ordre lægemiddelinteraktioner er null model valg for den "forventede IC50." Når to stoffer er kombineret, kan den kombination virkning kun sammenlignes med enkelt drug effekter. Når tre stoffer er kombineret, kan den kombination virkning sammenlignes med enkelt effekter eller parvise effekter. For eksempel, hvis alle parvise kombinationer af tre lægemidler er synergistiske, kan derefter forventes at disse stoffer vil vise en tre-vejs synergi. En tre-vejs interaktion afvigelse fra hvad der forventes af parvise interaktioner er blevet for nylig kaldt "emergent interaktion"16,17. For enkelhed beskriver vores protokol måling af den tre-vejs kombination "netto interaktion," som definerer den null model som enkelt drug effekter. De data, der er fremstillet af protokollen kan dog også bruges til at beregne den emergente interaktion af den tre-vejs kombination. I vores analyse definerede vi de forventede IC50 for tre-vejs kombination som gennemsnittet af de enkelt drug IC50s. Alternativt, den forventede IC50 kan defineres som et gennemsnit af IC50s af parvise kombinationer (~1.1-1.2). Når den observerede IC50 divideres med denne alternative forventede IC50, ydes opnåede FIC emergent FIC trevejs-kombination, som tidligere beskrevet12. Denne betragtning afslører, at LEV + NAL + PNG er mere synergistiske end hvad ville forventes af parvise interaktionerne mellem tre lægemidler, demonstrerer, at LEV + NAL + PNG har emergent synergi.

Drug kombinationer kan udstille overraskende høj eller lav effekt på en fænotype givet virkningerne af konstituerende narkotika, svarende til synergistisk eller antagonistisk lægemiddelinteraktioner, henholdsvis1,2,3. Brugen af synergistiske kombinationer kan tillade dosis-eskalering til effekten stigning og dosis-reduktion for bivirkning relief. Kombination behandlinger kan også anvende flere tilbageslag til cellulære maskiner, hvilket blokerer for potentielle evolutionære undslippe mekanismer til modstand4. Kombinationer af tre eller flere stoffer er derfor rutinemæssigt anvendes i patogen eller kræft behandling5.
Synergi og antagonisme er defineret ved en sammenligning mellem den observerede effekt af en kombination versus forventede virkning givet enkelt drug effekter. Blandt modellerne for lægemiddelinteraktioner, Loewe additivity er den strengeste og har en veldefineret null model ()figur 1)6, og afledt synergi/antagonisme interaktion er uafhængig af narkotika koncentration anvendt 6 , 7. men Loewe model er eksperimentelt dyrt selv for en parvis interaktion test. Drug interaktion assays traditionelt består af en 2D matrix af narkotika koncentration kombinationer (et skakternet assay) ()figur 2). Hvis 5 doser anvendes for hvert stof, så 25 kombinationer er nødvendige, svarer til en halvdel af en mikrotiterplade hvis eksperimenter er udført i replikeres. Omkostningerne ved denne tilgang forbyder synergi måling af Loewe additivity model for multi drug kombinationer af ()figur 3). For eksempel, for at teste en 10-vejs interaktion, ville traditionelle metoder kræve mere end 100 tusinde mikroplader, spærring eksperimentelle måling af høje synergier af den strenge, godt teoretiske og koncentration-uafhængig Loewe additivity model 8.
Aktuelle kliniske behandlinger anvender kun en brøkdel af mulige drug kombinationer. For eksempel, er den standard behandling af aktiv tuberkulose en kombination af tre antibiotika. Der er ca 20 antibiotika anvendes Mycobacterium tuberculosis (Mtb) behandling. Der er 1140 3-vejs kombinationer blandt 20 narkotika, hver med potentiale til at have en stærk synergi mod Mtb. Da der har været nogen omkostningseffektiv metode til at måle lægemiddelinteraktioner blandt mange lægemidler, forbliver potentielt livreddende synergistiske kombinationer uprøvet.
Her, vi beskriver en enkel protokol for at måle parvis og tre-vejs lægemiddelinteraktioner ved stikprøver kun diagonalen i et skakternet assay ()figur 4 og figur 5). Underliggende begrebet prøveudtagning diagonalen i et skakternet eksperiment var teoretiseret af Berenbaum i hans skelsættende arbejde i 19789. Denne tilgang har endnu, først for nylig blevet anvendt til narkotika synergy skærme10,11,12. Vi præsenterer vores protokol med Escherichia coli (E. coli) og vækst fænotype. Vi Bemærk dog, at protokollen er uafhængig af den biologiske arter og fænotype af interesse, og dermed kan anvendes til måling af høje stof synergi i andre biologiske sammenhænge.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

En synergistisk drug kombination har en højere effektivitet i forhold til virkningerne af enkelte stoffer. Skakternet assays, hvor narkotika er kombineret i mange doser, tillader følsomme måling af lægemiddelinteraktioner. Men disse assays er dyrt og skalere ikke godt for måling interaktion blandt mange lægemidler. Flere nyere undersøgelser har rapporteret drug interaktion målinger ved hjælp af en diagonal prøveudtagning af traditionelle skakternet assay. Denne alternative metode kraftigt reducerer omkostningerne ved drug interaktion eksperimenter og giver mulighed for interaktion måling for kombinationer med mange medikamenter. Her, beskriver vi en protokol for at måle de tre parvise interaktioner og en tre-vejs interaktion blandt tre antibiotika i to eksemplarer i fem dage, ved hjælp af kun tre 96-brønd mikroplader og almindeligt laboratorieudstyr. Vi præsenterer repræsentative resultater viser, at tre-antibiotikum kombination af Levofloxacin + Nalidixic syre + Penicillin G er synergistisk. Vores protokol kan skaleres til at måle interaktioner blandt mange lægemidler og i andre biologiske sammenhænge, giver mulighed for effektiv skærme for multi drug synergier mod patogener og tumorer.

Tidligere, har vi rapporteret parvise interaktionerne mellem tre lægemidler: LEV, NAL og PNG baseret på test i miniaturized skakternet assays, hvor to stoffer blev kombineret i en 4 x 4 matrix13,14. Mens NAL og LEV var synergistiske, blev PNG rapporteret at være antagonistiske med både LEV og NAL13,14. Her, vi kontrollerede disse parvise interaktioner og målt tre-vejs samspillet mellem disse tre lægemidler ved hjælp af en diagonal assay. Vores resultater viser, at LEV + NAL + PNG er en synergistisk 3-vejs antibiotika kombination. Skematisk repræsentationer for resultaterne af de enkelte forsøgsmetoden afsnit blev givet på højre side af figur 7 og figur 8. Her præsenterer vi og tolker repræsentative rå resultater fra tre plade behandlinger, der er anført i figur 9. Den øverste plade læsning svarer til seriel og lineær fortynding eksperimenter udført i trin 2 og 3. Nederst to plade aflæsninger er duplikerede interaktion plader udført i trin 4.
De rå data i figur 9 viser top vækst er omkring 0,55, at der er en 0,05 Ekstinktionen af selve mediet, som observeres i OD600 af de høje stof koncentrationer hvor der er ingen vækst. Derfor, vi definerer IC50 som (0.55-0.05)/2 = 0,25. For hver dosis-respons, er brønde placeret tættest til denne værdi vist med orange.
Den øverste halvdel af figur 9A viser resultaterne fra trin 2, seriel dosis-respons eksperiment. IC50 brønde for LEV er på kolonne 10 i to replikater, der svarer til 4 ng/mL. IC50 for NAL og PNG er på 3 µg/mL og 25 µg/mL, henholdsvis. Disse koncentrationer svarer til 1 x koncentration vist i figur 7B. Den nederste halvdel af figur 9B viser resultaterne fra trin 3, lineære dosis-respons forsøgene. LEV, NAL og PNG'S IC50 findes på 0,4 x 0,8 x og 1.2 x, henholdsvis. Disse koncentrationer er tildelt som 1 X IC50 for trin 4.
To plader svarende til to replikat forsøg er vist i figur 9B, hvor IC50 brønde er vist med orange. I pladen 1 har alle enkelt narkotika deres IC50 på 1 x koncentration. Den forventede IC50 for kombinationen parvis eller tre-vejs beregnes det aritmetiske gennemsnit af konstituerende narkotika, gør forventede IC50 for alle kombinationer også 1 x koncentration. I plade 2, LEV og PNG har deres IC50 på 1 x koncentration, men NAL IC50 er på 1,2 x. Den forventede IC50 for hver kombination er defineret ved hjælp af aritmetiske af disse IC50 værdier. For eksempel, den forventede IC50 for LEV + NAL og NAL + PNG er 1,1 x. Lægemiddelinteraktion score (FIC) for hver kombination beregnes ved at dividere observeret IC50 med den forventede IC50, som vist på højre side af pladerne. Inspektion af FIC snesevis af de to plader viser, at LEV + NAL og LEV + NAL + PNG er synergistiske, mens LEV + PNG og NAL + PNG er antagonistisk. FIC scorer opnået i de to plader er enige, støtte pålideligheden af protokollen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figur 1: Null modeldefinition for Loewe additivity drug interaktion model. To 5 x 5 matricer på en mikrotiterplade, hvor stof A øges lineært i en akse som vist til venstre, og en top koncentration af stoffet hæmmer en kvantificerbar fænotype (øverst til højre). Tilføjelsen af disse matricer er vist i midten, hvor de linjer, der forbinder equipotent stof en koncentrationer i hver enkelt drug har den samme koncentration som lægemiddel A. Når celler er tilføjet på denne "Skaktern" drug koncentration kombinationer, forventes det, at den registrerede fænotype på denne linje vil være svarende til brøndene det forbinder. I denne selv-selv drug interaktion eksperiment forventes isobole skildrer en fænotype (vist med en stiplet grøn linje) at være lineær, definere additivity null model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figur 2: parvise lægemiddelinteraktioner ifølge Loewe additivity drug interaktion model. Når to stoffer er kombineret i et skakternet assay Figur1, kan den observerede isophenotypic contour være lige, konvekse og konkave. Til højre er muligt isophenotypic konturer (stiplede grønne linjer) overlejret på skakternet assays. Drug kombinationer med lige isophenotypic konturer er Loewe-additiv, som konturer ikke er forskellige fra en self-self drug interaktion, som er Loewe-additiv pr. definition. Når isophenotypic contour er betydeligt konkave eller konvekse, er kombinationen synergistisk eller antagonistisk, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figur 3: tre-vejs lægemiddelinteraktioner ifølge Loewe additivity drug interaktion model. Ligner Skaktern assay for parvise interaktioner, tre-stoffer er kombineret i en 3D grid (en "checkercube"), hvor hver enkelt drug øges lineært i én akse. Hvis de tre stoffer var identiske, forventes isophenotypic overflade skal være flad, definere additivity for tre kombinationer af stof. Hvis overfladen er mere konkave eller konvekse end denne Loewe-additiv null model, er drug kombinationer synergistisk eller antagonistisk, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figur 4: Diagonal metode til at måle parvise lægemiddelinteraktioner. For hver skakternet assay måles kun de regioner, vist i magenta rektangler. i og ii er lineært stigende enkelt drug koncentrationer. III vurderes ved at lave en 1:1 blanding af to stoffer og lineært tilsætningen denne blanding, som om det var en enkelt drug. FIC er lig med den konstaterede IC50 i kombinationen divideret med det forventede IC50 af to enkelt narkotika. For Loewe additivity model, er den forventede IC50 tilnærmes af den gennemsnitlige IC50 for de to enkelt narkotika. En FIC værdi er 1 for Loewe-additiv par og er lavere eller højere end 1 for synergistisk eller antagonistisk par, henholdsvis2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figur 5: Diagonal metode til at måle tre-vejs lægemiddelinteraktioner. For hver checkercube assay måles kun de regioner, vist. i, ii og iii er lineært stigende enkelt drug koncentrationer. IV måles ved at lave en 1:1:1 blanding af tre lægemidler og lineært tilsætningen denne blanding, som om det var en enkelt drug. Fraktioneret hæmmende koncentration er lig med de observerede IC50 i kombinationen divideret med det forventede IC50 får tre enkelt lægemidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figur 6: arbejdsgang for diagonal metode protokollen beskrevet heri og opsætningsoplysningerne for hver mikrotiterplade. Pladen vist i dag 4 er gennemført i to eksemplarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figur 7: seriel og lineær fortynding dosis-respons forsøgene. (A) forberedelse af seriel fortynding dosis-respons for et stof og tilsvarende endelige drug koncentrationer. E. coli celler føjes til pladen; vækst er indspillet efter 16 h. seriel IC50, vist i orange, er valgt for hver enkelt drug for brug i den følgende dag 's lineær fortynding dosis-respons forsøgene. (B) forberedelsen af lineære fortynding dosis-respons for et stof og tilsvarende endelige drug koncentrationer. E. coli celler føjes til pladen; vækst er indspillet efter 16 h. For hvert stof, de valgte IC50s, der skal bruges i den følgende dag drug interaktion forsøg er vist i orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figur 8: Drug interaktion eksperimenter. Forberedelse af interaktion eksperimenter er lig enkelt drug lineære dosis-respons, bortset fra at en 1:1 eller 1:1:1 blanding af narkotika bruges til to eller tre stof dosis-respons, henholdsvis. Observeret IC50s for hver dosis-respons, afbildet i orange, der bruges til at beregne FIC scores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figur 9: repræsentant eksperimentresultater. Repræsentative resultater, der opnås ved hjælp af den beskrevne protokol er vist med detaljer i hovedteksten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonal metode til foranstaltning synergi blandt et vilkårligt antal af narkotika

I denne protokol beskriver vi hvordan man laver Loewe additivity-baseret drug interaktion målinger for parvis og tre-vejs drug kombinationer.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomisk hybridisering (Array CGH) til påvisning af genomiske Kopiér nummer Varianter

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ immunofluorescensassay at måle variationen i proteinniveauer på centrosomer

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Brug plusTipTracker Software til måling mikrotubulære Dynamics i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vækstkegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro assay til måling Phosphatidylethanolamin methyltransferaseaktivitet

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ metode til Sample Preparation med lav Cell Antal for TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Høj opløsning respirometri at måle mitokondrie funktion af intakt Beta celler i overværelse af naturlige forbindelser

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...