Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NIGMS Grant P50GM107618. De auteurs bedanken Zohar B. Weinstein voor de inzichtelijke opmerkingen en suggesties over het manuscript.

Opmerking: Een klein molecuul dat remt de groei van E. coli bacteriën kan worden gebruikt voor de diagonale methode. In dit protocol, Levofloxacine (LEV), nalidixic zuur (NAL), en penicilline G (PNG) zal worden gebruikt als een voorbeeld, aangezien deze geneesmiddelen een saillant drieweg synergie aantonen. De workflow van dit protocol wordt weergegeven zoals Figuur 6. Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur. Verse aliquots van bacteriën en drugs elke dag gebruiken. Uitvoeren van het experiment onder bioveiligheid niveaus geschikt voor E. coli.
1. voorbereiding stappen
<ol><li>Bereiden van Luria Bertani (LB) media door 25 g van de pond-Bouillon toe te voegen aan 1 liter gedistilleerd water en meng. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten en winkel de gesteriliseerde met autoclaaf media bij kamertemperatuur.</li>
	<li>E. coli glycerol voorraden voor te bereiden door het mengen van gelijke hoeveelheid steriele 50% glycerol en bacteriële cellen verdund tot OD600 = 1 in de pond-Bouillon en bevriezen van 150 µL aliquots in 1,5 mL microcentrifuge buizen bij-80 ° C.</li>
	<li>Los 20 mg van antibiotica, LEV, NAL en PNG in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) elke. LEV oplossing 100 x 0,2 µg/mL verdund door het mengen van 10 µL van LEV oplossing met 990 µL van DMSO. Gebruik van 0,2 mg/mL LEV, en 20 mg/mL NAL en PNG in de stappen van de procedure.</li>
	<li>Aliquot 50 µL van elke antibioticum 1,5 mL microcentrifuge buizen en bevriezing bij-20 ° C.</li>
	<li>Neem één 150 µL aliquot van E. coli van-80 ° C. Ontdooien.</li>
	<li>Voeg 100 µL van E. coli glycerol voorraad in 5 mL LB media in een tube van 14 mL cultuur.</li>
	<li>Schud de buizen in een incubator 37 ° C's nachts bij 200 omwentelingen per minuut.</li>
</ol>2. seriële verdunning dosis / respons-Experiment
<ol><li>Nemen van een hoeveelheid drugs LEV, NAL en PNG van-20 ° C, laat ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten te ontdooien en bereiden voor seriële verdunningen van deze drugs.</li>
	<li>1100 µL van LB - 10% sol door het mengen van 990 µL van LB-media en 110 µL van oplosmiddel (DMSO) voorbereiden.</li>
	<li>500 µL van LB - 10% LEV door het mengen van 450 µL van LB-media en 50 µL van LEV voorbereiden.</li>
	<li>Vortex LB - 10% sol voor 5 s bij de hoogste instelling. Voeg 20 µL van sol LB - 10% op de top vier rijen van putten in een 96-Wells-microplate.</li>
	<li>Vortex LB - 10% LEV voor 5 s bij de hoogste instelling. 20 µL van LB - 10% LEV toevoegen aan de eerste put in rij A.</li>
	<li>Maak twee-voudige seriële verdunning voor LB - 10% LEV door middel van 20 µL uit de eerste put, toe te voegen aan de tweede put, pipetting op en neer vijfmaal. Herhaal dit voor alle putjes sequentieel tot de 11e goed, die met 40 µL (figuur 7A eindigt).</li>
	<li>Verwijderen en gooi deze weg 20 µL van de inhoud van de 11e goed, met behulp van een micropipet.</li>
	<li>Herhaal stap 2.3-2.7 voor de drugs NAL en PNG met behulp van de tweede en derde rij van de microplate, respectievelijk.</li>
	<li>Herhaal stap 2.3-2.7 voor de drug LEV opnieuw op vierde rij als een interne positieve controle.</li>
	<li>Met behulp van een spectrofotometer, meten de OD600 van een 1:10 verdunning van de cultuur (stappen 1.5-1.7).</li>
	<li>Verdun de cellen in 5 LB media op een OD600 van 0,01 mL. Giet in een reservoir.</li>
	<li>Met behulp van een meerkanaals micropipet, 80 µL van de verdunde cellen aan de drug seriële verdunningen bereid in stap 2.4-2.9 toevoegen. De laatste drug concentraties in elk putje wordt weergegeven in figuur 7A. Het zegel van de plaat om te voorkomen dat de verdamping.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Start een nieuwe bacteriecultuur gebruiken in stap 3 (Herhaal stappen 1.5-1.7).</li>
</ol>3. lineaire verdunning dosis / respons-Experiment
<ol><li>Meet de extinctie van de600 OD voor seriële verdunning dosis / respons-plaat uit stap 2 met behulp van een afleesapparaat (figuur 7A juiste) en interpreteren van de resultaten op basis van de volgende stappen uit.</li>
	<li>Normaliseren van de groei door de groei in elk putje met de groei van de drug oncontroleerbaar voor elke rij te verdelen en berekenen procent groei door het normaliseren van de OD600tot geen drug voorwaarde.</li>
	<li>Voor elk medicijn, zoekt u de putten die ~ 50% groeiremming (IC50), weergegeven in oranje in figuur 7A gelijkhebben. De concentratie in deze putten als "seriële IC50" voor elk medicijn toewijzen.</li>
	<li>Verse drug aliquots ontdooien, bereiden 1 mL van LB - 10% sol door het mengen van LB-media en oplosmiddel (DMSO) in een 9:1 ratio en de LB - 10% drug door het mengen van LB-media en drugsgebruik in een 9:1-verhouding, waar de concentratie van de drug 100 x van elk medicijn de seriële IC50 is alvorens toe te voegen de LB-media , zoals gekozen bij stap 3.3.</li>
	<li>Bereid lineair toenemende doses van drugs LEV, NAL en PNG in 11 concentraties, door het mengen van LB - 10% drug en LB - 10% sol in volumes weergegeven in figuur 7B.</li>
	<li>Bereiden lineair toenemende doses van LEV op vierde rij als een interne positieve controle.</li>
	<li>Meten van de OD600 van de 1:10 verdunning van de cultuur begon in stap 2.14.</li>
	<li>Verdun de cellen in 5 LB media op een OD600 van 0,01 mL. Giet in een reservoir.</li>
	<li>Voeg 80 µL van de verdunde cellen aan de drug lineaire verdunningen bereid in stap 3.6 met behulp van een meerkanaals micropipet. De laatste drug concentraties in elk putje wordt weergegeven in figuur 7B. Opmerking: Het midden goed in de dosis-respons ontvangt de seriële IC50 voor deze drug. Zegel plaat om te voorkomen dat de verdamping.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Start twee verse bacteriële culturen gebruiken in stap 4 (Herhaal stappen 1.5-1.7).</li>
</ol>4. de diagonale Drug interactie Experiment
<ol><li>Meet de extinctie van de600 OD voor lineaire verdunning dosis-respons vanaf stap 3 (figuur 7B).</li>
	<li>Kies voor elk medicijn, de concentratie die resulteerde in IC50 en bereiden drug LEV, NAL en PNG in 100 x IC50 concentraties.</li>
	<li>Verse drugs ontdooien, bereiden van 100 x IC50 voor elk drug en drug van 1:1 mengsels te bereiden door volume van LEV + NAL, LEV + PNG en NAL + PNG en 1:1:1 drug mengsel volumepercentage van LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Twee platen voorbereiden drug interactie experimenten zoals aangegeven in Figuur 8.</li>
	<li>Meten van de OD600 van de 1:10 verdunning van de culturen in stap 3.11 begonnen.</li>
	<li>Bereiden van OD600 = 0,01 verdunningen van twee culturen in twee 10 mL van LB-media.</li>
	<li>Voeg 80 µL van de cellen van cultuur 1 en 2 op bord 1 en 2, respectievelijk. Het zegel van de platen om te voorkomen dat de verdamping. Incubeer de platen gedurende 16 uur bij 37 ° C.</li>
</ol>5. de diagonale Drug interactie Scores
<ol><li>Maatregel de extinctie600 OD voor interactie met de diagonale drug experimenteren platen uit stap 4.</li>
	<li>Normaliseren van de groei door de groei in elk putje met de groei in de geen controle op drugs goed voor elke rij te verdelen.</li>
	<li>Zoek de heeft groeiremming dichtst bij IC50, weergegeven in oranje in Figuur 8 juiste kolom voor elke rij. Toewijzen van IC50 gebaseerd op de relatieve concentratie van drug in dit goed.</li>
	<li>Berekenen verwachte IC50 voor LEV + NAL, LEV + PNG en NAL + PNG en LEV + NAL + PNG dosis-respons, gemiddeld de IC50 voor de enkele drugs in elke combinatie. Merk op dat gemiddeld een eenvoudige benadering voor exacte verwachte IC50 berekening zoals beschreven voor12.</li>
	<li>Fractionele remmende concentratie ("fic") scores berekenen door het verdelen van de waargenomen IC50 door de verwachte IC50 in elke combinatie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gebruik van combinaties van de drug tegen ziekteverwekkers of tumoren is een aantrekkelijk vooruitzicht, met name onder de omstandigheden van de drogen antibiotica pijpleiding. Dit potentieel wordt echter belemmerd door ten minste twee problemen. De eerste moeilijkheid is het astronomisch aantal mogelijke combinaties. Er zijn bijvoorbeeld 4950 paarsgewijze combinatiemogelijkheden onder 100 antibiotica. Alle mogelijke combinaties onder 100 antibiotica (2100) is op de dezelfde orde van grootte met het aantal bacteriën op aarde (~ 10-30). Hoe te voorspellen sterk synergetische combinaties van deze mogelijkheden is het onderwerp van talrijke computationele geweest. Het tweede probleem is de meting van eersterangs drug-interacties. Overwegen die een computationele platform voorstellen kan dat een bepaalde combinatie van 10-drug sterk synergetische tegen een bepaalde ziekteverwekker is. Traditionele methoden voor het testen van de interactie van de drug is te duur om te verifiëren of deze hypothese te weerleggen, daarom is de studie van synergie tussen veel drugs buiten de begrenzing van wetenschappelijk onderzoek geweest. De diagonale methode, die bijna 30 jaar geleden voor het eerst werd voorgesteld en werd gebruikt in een paar recente synergie schermen zorgen voor een sterke basis voor het eerste probleem, doordat het testen van de interactie tussen vele paren. Het is het tweede probleem opgelost door een informatieve bemonstering van de traditionele tests en laat de studie van eersterangs drug-interacties.
Nog belangrijker is stellen wij vast dat onze protocol maakt gebruik van een lineaire doseren voor drug interactie metingen, om de gevoeligheid voor het opsporen van zelfs zwakke interacties. Tot vaststelling van de juiste concentratiebereik voor lineaire doseren is een uitdagende taak. Door het eerste uitvoeren een seriële verdunning, maken we een geïnformeerd besluit over de zoekruimte voor lineaire doseren. Echter, het protocol kan worden gewijzigd voor het gebruik van 2-fold of hogere seriële verdunningen voor drugs testen van interactie. Een dergelijke wijziging zou verkorten experiment en laat het testen van meer interacties; het zou echter gevoeligheid te detecteren alleen sterk synergistische of antagonistische interacties.
Het protocol we beschreven toont de meting van de paarsgewijze of drieweg interacties. Een kritisch aspect van het protocol is dat enkele agenten op de dezelfde plaat als de combinatie, tot een minimum beperken van vooringenomenheid als gevolg van de variaties van de plaat. Daarom kan het protocol voor het meten van interacties tot 7-weg combinaties door triviale wijzigingen worden aangepast. Combinaties van meer dan 7 drugs vergt meer dan een 96-Wells-microplate en aanvullende overwegingen moeten men zich ervan vergewissen van de juiste data integratie, zoals Inter plaat wordt gerepliceerd.
Een bekende beperking van de diagonale methode is de beperking dat elk medicijn in de bepaling het fenotype van belang remmen moet. De diagonale methode is dus niet nuttig voor het begrijpen van de interacties tussen actieve agenten en inerte hulpstoffen. Dergelijke 'versterkend' interacties kunnen worden bestudeerd onder alternatieve modellen zoals Bliss of hoogste één Agent modellen.
Een belangrijke overweging voor de analyse van de interactie van de drug van de eersterangs is de keuze van de null model voor de "verwacht IC50." Wanneer twee geneesmiddelen worden gecombineerd, de combinatie van effect kan alleen worden in vergelijking met de enkele drug effecten. Wanneer drie drugs worden gecombineerd, kan de combinatie van effect worden vergeleken met de afzonderlijke effecten of paarsgewijze effecten. Bijvoorbeeld, als alle paarsgewijze combinaties van drie drugs synergetische, kan dan het worden verwacht dat deze drugs een drieweg synergie zal tonen. Een drieweg interactie van afwijking van wat wordt verwacht van de paarsgewijze interacties heeft onlangs zijn bijnaam "opkomende interactie"16,17. Ons protocol beschrijft voor eenvoud, de meting van de three-way combinatie van "netto interactie," waarin de null model als één drug effecten. De gegevens die wordt opgehaald uit het protocol kan echter ook worden gebruikt voor het berekenen van de opkomende interactie van de combinatie van drie-weg. In onze analyse, hebben we de verwachte IC50 voor de combinatie van drie-weg gedefinieerd als het gemiddelde van de enkele drug IC50s. U kunt ook kan de verwachte IC50 worden gedefinieerd als het gemiddelde van de IC50s van de paarsgewijze combinaties (~1.1-1.2). Wanneer de waargenomen IC50 wordt gedeeld door deze alternatieve verwachte IC50, voorziet de verkregen "fic" in de opkomende "fic" de combinatie van drie-weg, zoals eerder beschreven12. Deze overweging blijkt dat LEV + NAL + PNG meer synergie dan zou worden verwacht van de paarsgewijze interacties tussen drie drugs is, aan te tonen dat LEV + NAL + PNG opkomende synergie heeft.

Drug combinaties kunnen vertonen verrassend hoog of laag effect op een fenotype gegeven van de effecten van de samenstellende drugs, overeenkomt met de drug synergistische of antagonistische interacties, respectievelijk1,2,3. Het gebruik van synergetische combinaties mogelijk dosis-escalatie voor verhoging van de doeltreffendheid en dosis-vermindering voor neveneffect verlichting. Combinatie behandelingen mogen ook meerdere tegenslagen op mobiele machines, waardoor het blokkeren van potentiële mechanismen van de evolutionaire ontsnappen aan weerstand4toepassen. Daarom worden combinaties van drie of meer drugs routinematig gebruikt in pathogen of kanker behandeling5.
Synergie en tegenstellingen worden gedefinieerd door een vergelijking tussen het waargenomen effect van een combinatie ten opzichte van een verwachte effect gegeven individuele drug effecten. Onder de modellen voor interactie van de drug, Loewe additiviteit is de strengste en heeft een welomschreven null model ()Figuur 1)6, en de interactie van afgeleid synergie/antagonisme is onafhankelijk van de concentratie van de drug gebruikt 6 , 7. de Loewe-model is echter experimenteel duur zelfs voor een paarsgewijze interactie-test. Drug interactie assays traditioneel bestaan uit een 2D-matrix van drug concentratie combinaties (een dambord-assay) ()Figuur 2). Als 5 doses er voor elk medicijn gebruikt worden, dan 25 combinaties vereist zijn, dat overeenkomt met een helft van een microplate als experimenten zijn uitgevoerd in repliceren. De kosten van deze aanpak verbiedt synergie meting door de Loewe additiviteit model voor multi drug combinaties ()Figuur 3). Bijvoorbeeld, als u wilt testen een 10-manier interactie, zou traditionele methoden vereisen meer dan 100 duizend microplates, behoudens experimentele meting van eersterangs synergieën door de strenge, goed theorized en concentratie-onafhankelijke Loewe additiviteit model 8.
Huidige klinische behandelingen gebruiken slechts een fractie van mogelijke drug combinaties. De standaardbehandeling van actieve tuberculose is bijvoorbeeld een combinatie van drie antibiotica. Er zijn ongeveer 20 antibiotica gebruikt bij behandeling van Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Er zijn 3-weg 1140 tot 20 drugs, elk met het potentieel te hebben van een sterke synergie tegen Mtbcombinaties mogelijk. Er is geen kosteneffectieve methode voor het meten van de interactie van de drug onder veel drugs, blijven levensreddende synergetische combinaties ongeteste.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het meten van de interactie van de drug van de paarsgewijze en drieweg steekproefsgewijs alleen de diagonaal van een dambord assay ()Figuur 4 en Figuur 5). Het onderliggende concept van bemonstering van de diagonaal van een dambord experiment was theorie door Berenbaum in zijn baanbrekende werk in 19789. Nog, deze aanpak heeft pas onlangs vereffend drug synergie schermen10,11,12. We presenteren ons protocol met Escherichia coli (E. coli) en het fenotype van de groei. Wij stellen echter vast dat het protocol onafhankelijk is van de biologische soorten en fenotype van belang, en daarom kan worden toegepast op de meting van eersterangs drug synergie in andere biologische verbanden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

De combinatie van een synergetische drug heeft een grotere werkzaamheid ten opzichte van de effecten van individuele drugs. Dambord testen, waar drugs worden gecombineerd in vele doses, kunnen gevoelige meting van de interactie van de drug. Echter, deze tests zijn duur en niet goed voor het meten van de interactie tussen veel drugs doen schaal. Verschillende recente studies hebben gemeld drug interactie metingen met behulp van een diagonale steekproef van de traditionele dambord assay. Deze alternatieve methode sterk vermindert de kosten van de drug interactie experimenten en interactie meting voor combinaties met veel drugs kunt. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de drie paarsgewijs interacties en een drie-weg interactie tussen drie antibiotica in tweevoud, in vijf dagen, met behulp van slechts drie 96-Wells microplates en gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden. Wij presenteren representatieve resultaten laten zien dat de combinatie van de drie-antibioticum van Levofloxacine + Nalidixic zuur + penicilline G synergetische. Ons protocol schalen omhoog voor het meten van de interacties tussen veel drugs en in andere biologische verbanden, waardoor voor efficiënte schermen voor multi drug synergieën tegen ziekteverwekkers en tumoren.

Eerder, hebben we de paarsgewijze interacties tussen drie drugs gemeld: LEV, NAL en PNG op basis van testen in verkleinde dambord testen, waar twee geneesmiddelen werden samengevoegd in een 4 x 4 matrix13,14. Terwijl NAL en LEV synergetische waren, werd PNG gemeld dat antagonistische met LEV zowel NAL13,14. Hier, wij gecontroleerd deze paarsgewijze interacties en de drieweg interactie tussen deze drie drugs met een diagonale assay gemeten. Onze resultaten tonen aan dat LEV + NAL + PNG is een synergetische antibiotische combinatie van de 3-weg. Schematische voorstellingen voor de resultaten van de individuele experimentele procedure secties werden gegeven aan de rechterkant van de Figuur 7 en Figuur 8. Hier presenteren we en interpreteren van representatieve rauwe resultaten van drie lezingen van de plaat, die worden gegeven in Figuur 9. De bovenste plaat lezing komt overeen met seriële en lineaire verdunning experimenten uitgevoerd in stap 2 en 3. De onderste twee plaat lezingen zijn dubbele interactie platen uitgevoerd in stap 4.
De ruwe gegevens in Figuur 9 ziet u dat de hoogste groei ongeveer 0,55 is, maar er een 0,05 optische dichtheid van de media zelf is, zoals waargenomen in de OD600 van de drug van de hoge concentraties waar er geen groei is. Daarom, definiëren we als IC50 (0.55-0.05)/2 = 0,25. Voor elke dosis-respons, worden de putjes dichtst gelegen aan deze waarde weergegeven met oranje.
De bovenste helft van figuur 9A toont de resultaten van stap 2, seriële dosis / respons-experiment. De putten van de IC50 voor LEV is in kolom 10 in twee replicaten, die correspondeert met 4 ng/mL. De IC50 voor NAL en PNG zijn op 3 µg/mL en 25 µg/mL, respectievelijk. Deze concentraties komen overeen met de concentratie van de 1 x weergegeven in figuur 7B. De onderste helft van figuur 9B toont de resultaten van stap 3, lineaire dosis / respons-experimenten. LEV, NAL en PNG's IC50 zijn te vinden op 0,4 x, x 0.8 en 1.2 x, respectievelijk. Deze concentraties worden toegewezen als het 1 X IC50 voor stap 4.
Twee platen overeenkomt met twee repliceren experimenten worden weergegeven in figuur 9B, waar de IC50 wells worden weergegeven met oranje. In plaat 1 hebben alle interne drugs hun IC50 1 x concentratie. De verwachte IC50 voor de paarsgewijze of drieweg combinatie wordt berekend door het rekenkundig gemiddelde van de samenstellende drugs, waardoor verwachte IC50 voor alle combinaties ook 1 x concentratie. In plaat 2, LEV en PNG hebben hun IC50 bij de concentratie 1 x, maar NAL IC50 is 1,2 x. De verwachte IC50 voor elke combinatie wordt gedefinieerd met behulp van de rekenkunde middelen van deze waarden IC50. Bijvoorbeeld, de verwachte IC50 voor LEV + NAL en NAL + PNG is 1.1 x. De interactie van de drug score ("fic") voor elke combinatie wordt berekend door waargenomen IC50 met de verwachte IC50, zoals weergegeven op de rechterkant van de platen. Inspectie van de scores van de "fic" van de twee platen toont aan dat de LEV + NAL en LEV + NAL + PNG synergetische, terwijl LEV + PNG en NAL + PNG antagonistische zijn. "Fic" scores verkregen in de twee platen zijn het eens, de betrouwbaarheid van het protocol ondersteunen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figuur 1: model definitie voor Loewe additiviteit drug interactie model Null. Twee 5 x 5 matrices over een microplate, waar drugs A lineair wordt verhoogd in één as zoals links op elke pagina, en een hoogste concentratie van medicijn remt een kwantificeerbare fenotype (rechtsboven). De toevoeging van deze matrices wordt weergegeven in het midden, waar de lijnen die equipotent drug een concentraties in elk één medicijn dezelfde concentratie als drug A. hebben Wanneer cellen worden toegevoegd op deze "dambord" drug concentratie combinaties, verwacht wordt dat het opgenomen fenotype op deze regel zullen equivalent voor de putten die het verbindt. In dit zelf-zelf drug interactie experiment, de isobole beeltenis van een fenotype (weergegeven met een groene stippellijn) naar lineaire, definiëren de additiviteit null model verwachting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figuur 2: de interactie van de paarsgewijze drug naar model van de interactie van de drug van Loewe additiviteit. Wanneer twee geneesmiddelen worden gecombineerd in een dambord assay zoals in Figuur 1, wellicht de contour van de waargenomen isophenotypic recht, bolle of holle. Aan de rechterkant zijn de contouren van de mogelijke isophenotypic (groene stippellijnen) dambord assays bovenop. Drug combinaties met rechte isophenotypic contouren zijn Loewe-additief, zoals de contouren zijn niet verschillend van een zelf-zelf drug-interacties, die Loewe-additief is per definitie. Wanneer de isophenotypic contour aanzienlijk concave of convexe is, is de combinatie synergistische of antagonistische, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figuur 3: interactie van de drug van de drie-weg naar model van de interactie van de drug van Loewe additiviteit. Gelijkaardig aan het dambord assay voor paarsgewijze interacties, drie-drugs worden gecombineerd in een 3D-raster (een "checkercube"), waar elk medicijn lineair wordt verhoogd op één as. Als de drie drugs identiek zijn, wordt het isophenotypic oppervlak plat, definiëren de additiviteit voor drie drug combinaties verwacht. Als het oppervlak meer concave of convexe dan dit Loewe-additief null model is, zijn drug combinaties synergistische of antagonistische, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figuur 4: diagonale methode voor het meten van de interactie van de drug van de paarsgewijze. Voor elke dambord assay, worden alleen de regio's getoond in magenta rechthoeken gemeten. i en ii zijn lineair oplopende enkele drug concentraties. III wordt beoordeeld door het maken van een 1:1-mengsel van twee geneesmiddelen en dit mengsel lineair titrating alsof het een enkele drug. Het "fic" is gelijk aan de waargenomen IC50 in de combinatie gedeeld door de verwachte IC50 voor twee enkele geneesmiddelen. Voor de Loewe additiviteit model, wordt de verwachte IC50 benaderd door de gemiddelde IC50 van de twee enkele geneesmiddelen. Een "fic" waarde is 1 voor Loewe-additief paren en lager of hoger is dan 1 voor synergistische of antagonistische paren, respectievelijk2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figuur 5: Diagonal methode voor het meten van de interactie van de drug van drieweg. Voor elke checkercube assay, worden alleen de regio's getoond gemeten. i, ii en iii zijn lineair oplopende enkele drug concentraties. IV wordt gemeten door het maken van een 1:1:1 mengsel van de drie drugs en lineair titrating dit mengsel, alsof het een enkele drug. De fractionele remmende concentratie is gelijk aan de waargenomen IC50 in de combinatie gedeeld door de verwachte IC50 gegeven drie één drugs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figuur 6: Workflow voor het protocol van de diagonale methode die hierin worden beschreven en de instellingsdetails voor elke microplate. De plaat weergegeven in dag 4 is uitgevoerd in tweevoud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figuur 7: seriële en lineaire verdunning dosis / respons-experimenten. (A) voorbereiding van seriële verdunning dosis-respons voor een drug en de bijbehorende concentraties van de laatste drug. E. coli cellen worden toegevoegd aan de plaat; groei is opgenomen nadat 16 h. seriële IC50, weergegeven in oranje, voor elk medicijn is geselecteerd voor gebruik in de volgende dag lineaire verdunning dosis / respons-experimenten. (B) voorbereiding van lineaire verdunning dosis-respons voor een drug en de bijbehorende concentraties van de laatste drug. E. coli cellen worden toegevoegd aan de plaat; groei is afgelezen na 16 h. Voor elk medicijn, de geselecteerde IC50s die wordt gebruikt in de volgende dag drug interactie experimenten staan in oranje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figuur 8: experimenten van de interactie van de Drug. Voorbereiding van interactie experimenten is vergelijkbaar met één drug lineaire dosis-respons, behalve dat een 1:1 of 1:1:1-mengsel van drugs wordt gebruikt voor twee of drie drugs dosis-respons, respectievelijk. IC50s voor elke dosis-respons, afgebeeld in oranje, waargenomen worden gebruikt om het "fic" scores te berekenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figuur 9: vertegenwoordiger experiment resultaten. Representatieve resultaten verkregen met behulp van het protocol beschreven worden weergegeven, met details die in de hoofdtekst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonale methode maatregel synergie tussen een willekeurig aantal Drugs

In dit protocol beschrijven we how to make Loewe additiviteit gebaseerde drug interactie metingen voor paarsgewijs en drieweg drug combinaties.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Groei Kegels

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...