Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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Ce travail a été financé par NIGM Grant P50GM107618. Les auteurs remercient Zohar B. Weinstein pour des observations perspicaces et suggestions sur le manuscrit.

Remarque : Toute petite molécule qui inhibe la croissance de bactéries e. coli peut être utilisée pour la méthode diagonale. Dans le présent protocole, la lévofloxacine (LEV), l’acide nalidixique (NAL) et la pénicilline G (PNG) serviront à titre d’exemple, car ces médicaments démontrent une synergie de trois voies principales. Le flux de travail de ce protocole est montré comme la Figure 6. Effectuer toutes les étapes à la température ambiante. Utiliser des aliquotes frais des bactéries et des médicaments chaque jour. Réaliser l’expérience selon les niveaux de biosécurité appropriées pour e. coli.
1. étapes de préparation
<ol><li>Préparer les médias Luria-Bertani (LB) en ajoutant les 25 g de bouillon LB à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min et stocker les médias stérilisés à l’autoclave à température ambiante.</li>
	<li>Préparer des stocks de glycérol d’e. coli en mélangeant des volumes égaux de glycérol stérile à 50 % et des cellules bactériennes dilués à OD600 = 1 dans le bouillon LB et geler 150 µL d’extraits dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL à-80 ° C.</li>
	<li>Dissoudre 20 mg d’antibiotiques, LEV, NAL et PNG dans 1 mL de diméthyl sulfoxyde (DMSO). Diluer LEV solution x 100 à 0,2 µg/mL en mélangeant 10 µL de solution LEV 990 µl de DMSO. Utilisez LEV de 0,2 mg/mL et 20 mg/mL NAL et PNG dans les étapes de la procédure.</li>
	<li>Aliquote 50 µL de chaque antibiotique pour tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et gel à-20 ° C.</li>
	<li>Quantité de prendre un 150 µL d’Escherichia coli de-80 ° C. Dégel.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de stock de glycérol d’e. coli dans 5 mL de médias LB dans un tube à culture 14 mL.</li>
	<li>Secouer les tubes dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit à 200 tr/min.</li>
</ol>2. les dilutions Dose-Response Experiment
<ol><li>Prélever une partie aliquote de médicaments LEV, NAL et PNG de-20 ° C, les laisser à température ambiante pendant 10 min à décongeler et préparer des dilutions successives de ces médicaments.</li>
	<li>Préparer les 1100 µL de LB - 10 % sol en mélangeant 990 µL de milieux LB et 110 µL de solvant (DMSO).</li>
	<li>Préparer 500 µL de LEV LB - 10 % en mélangeant 450 µL des médias LB et 50 µL de LEV.</li>
	<li>Sol LB - 10 % Vortex pendant 5 s au réglage plus élevé. Ajouter 20 µL de sol LB - 10 % pour les rangées de quatre principaux de puits dans une microplaque 96 puits.</li>
	<li>Vortex LEV LB - 10 % pour 5 s au réglage plus élevé. Ajouter 20 µL de LEV LB - 10 % dans le premier puits en ligne A.</li>
	<li>Préparer la dilution en série double pour LEV LB - 10 % en prenant 20 µL du premier puits, ajoutant à la deuxième puits, pipetage et descendre cinq fois. Répétez cette opération pour tous les puits dans l’ordre jusqu’au puits, 11 qui se termine avec 40 µL (Figure 7 a).</li>
	<li>Retirez et jetez 20 µL du contenu du 11 Eh bien, à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,3 à 2,7 pour les médicaments NAL et PNG à l’aide des deuxième et troisième rangées de la microplaque, respectivement.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,3 et 2,7 pour la drogue LEV encore au quatrième rang comme contrôle positif interne.</li>
	<li>À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer l' OD600 d’un 01:10 dilution de la culture (étapes 1,5 à 1,7).</li>
	<li>Diluer les cellules dans 5 mL de médias LB à une OD600 de 0,01. Versez dans un réservoir.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette multicanaux, ajouter 80 µL des cellules dilués pour les dilutions en série médicament préparées à l’étape de 2,4 à 2,9. Les concentrations de médicament final dans chaque puits est illustrée à la Figure 7 a. Sceller la plaque pour empêcher l’évaporation.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.</li>
	<li>Démarrez une nouvelle culture bactérienne à utiliser à l’étape 3 (répétez les étapes 1,5 à 1,7).</li>
</ol>3. expérience de relation Dose-effet de Dilution linéaire
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour plaque de dose-réponse de dilution en série de l’étape 2 en utilisant un lecteur de plaque (Figure 7 a droite) et interpréter les résultats selon les étapes suivantes.</li>
	<li>Normaliser la croissance en divisant la croissance de chaque puits avec la croissance sans le contrôle des drogues pour chaque ligne et calculer le pourcentage de croissance en normalisant OD600à aucune condition de médicament.</li>
	<li>Pour chaque médicament, localiser les puits qui ont environ 50 % inhibition de la croissance (CI50), illustrée en orange dans la Figure 7 a droite. Affecter la concentration dans ces puits comme « serial IC50 » pour chaque médicament.</li>
	<li>Décongeler les aliquotes de drogue douce, préparer 1 mL de sol LB - 10 % en mélangeant des médias LB et solvant (DMSO) dans un rapport de 9:1 et une drogue LB - 10 % en mélangeant LB médias et la drogue dans un rapport de 9:1, où la concentration du médicament est 100 x d’IC50 de série de chaque médicament avant d’ajouter le support de la LB , choisi à l’étape 3.3.</li>
	<li>Préparer linéairement croissante de doses de médicaments LEV, NAL et PNG 11 concentrations, en mélangeant la drogue LB - 10 % et sol LB - 10 % en volumes, illustré à la Figure 7 b.</li>
	<li>Préparer des doses linéairement croissantes de LEV au quatrième rang comme contrôle positif interne.</li>
	<li>Mesurer l' OD600 de la 01:10 dilution de la culture a commencé à l’étape 2.14.</li>
	<li>Diluer les cellules dans 5 mL de médias LB à une OD600 de 0,01. Versez dans un réservoir.</li>
	<li>Ajouter 80 µL des cellules dilués sur les dilutions linéaire de médicament préparées à l’étape 3.6 à l’aide d’une micropipette multicanaux. Les concentrations de médicament final dans chaque puits est illustrée à la Figure 7 b. Remarque : Le milieu bien dans la relation dose-réponse recevra l’IC50 série pour ce médicament. Flasque pour éviter l’évaporation.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.</li>
	<li>Commencer à deux cultures bactériennes fraîches à utiliser à l’étape 4 (répétez les étapes 1,5 à 1,7).</li>
</ol>4. diagonale Drug Interaction Experiment
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour dilution linéaire dose-réponse de l’étape 3 (Figure 7 b).</li>
	<li>Pour chaque médicament, choisir la concentration qui a abouti à la CI50 et prépare des drogues LEV, NAL et PNG 100 x IC50 concentrations.</li>
	<li>Décongeler les drogues douce, préparer 100 x IC50 pour chaque médicament et préparer des mélanges de drogues de 1:1 en volume de LEV + NAL, LEV + PNG et NAL + PNG et 1 : mélange 1:1 en volume de LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Préparer deux plaques pour des expériences d’interaction médicament tel qu’illustré à la Figure 8.</li>
	<li>Mesurer l' OD600 de la 01:10 dilution des cultures a commencé à l’étape 3.11.</li>
	<li>Préparer l’OD600 = 0,01 dilutions de deux cultures en deux 10 mL des médias LB.</li>
	<li>Ajouter 80 µL des cellules de culture 1 et 2 sur les plaques 1 et 2, respectivement. Sceller les plaques pour empêcher l’évaporation. Incuber les boîtes pendant 16 h à 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonale Drug Interaction Scores
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour interaction médicamenteuse diagonale expérimenter des plaques de l’étape 4.</li>
	<li>Normaliser la croissance en divisant la croissance de chaque puits avec la croissance dans le contrôle des drogues aucun bien pour chaque ligne.</li>
	<li>Pour chaque ligne, recherchez la colonne qui a inhibition de la croissance plus proche de la CI50, ci-contre en orange sur la Figure 8 . Assigner l’IC50 basée sur la concentration relative des drogues dans ce puits.</li>
	<li>Pour LEV + NAL, LEV + PNG et NAL + PNG et LEV + NAL + PNG doses-réponses, calculer IC50 attendus par une moyenne de la CI50 de la drogue unique dans chaque combinaison. Notez qu’en moyenne est une approximation simple pour calcul exact d’IC50 attendu comme décrit avant le12.</li>
	<li>Calculer les scores de la Concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) en divisant l’IC50 observée par l’IC50 attendues dans chaque combinaison.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’utilisation de combinaisons de médicaments contre les agents pathogènes ou des tumeurs est une perspective attrayante, en particulier dans les circonstances de l’oléoduc antibiotique séchage. Cependant, ce potentiel est entravé par au moins deux difficultés. La première difficulté est le nombre astronomique de combinaisons possibles. Il y a, par exemple, 4950 combinaisons par paires possibles parmi 100 antibiotiques. Toutes les combinaisons possibles entre 100 antibiotiques (2100) est sur le même ordre de grandeur avec le nombre de bactéries sur la terre (~ 1030). Comment prévoir les combinaisons fortement synergiques parmi ces possibilités, a fait l’objet de nombreuses études computationnelles. La deuxième difficulté est la mesure des interactions médicamenteuses d’ordre élevé. Considérer qu’une plateforme de calcul peut suggérer qu’une certaine combinaison de 10 drogues est fortement synergique contre un certain agent pathogène. Les méthodes traditionnelles pour tester les interactions est trop coûteux de vérifier ou d’infirmer cette hypothèse, c’est pourquoi l’étude de la synergie entre les nombreux médicaments a été en dehors des limites de la recherche scientifique. La méthode diagonale, ce qui a été proposée il y a près de 30 ans et a été utilisée dans quelques écrans de synergie récentes fournissent une base solide pour le premier problème, en permettant l’analyse de l’interaction entre plusieurs paires. Il résout le problème de la second par un échantillonnage informatif des analyses traditionnelles et permet l’étude des interactions médicamenteuses d’ordre élevé.
Ce qui est important, nous notons que notre protocole utilise un dosage linéaire pour les mesures d’interaction médicamenteuse, de fournir la sensibilité pour la détection des interactions faibles même. Portant création de la gamme de concentration juste pour le dosage linéaire est une tâche difficile. D’abord une dilution en série, nous prendre une décision éclairée sur l’espace de recherche pour le dosage linéaire. Toutefois, le protocole peut être modifié pour utiliser 2 fois ou des dilutions plus élevées pour drug interaction stable. Une telle modification serait de raccourcir le temps de l’expérience et permettra de tester des interactions plus ; Cependant, il aurait la sensibilité pour détecter des interactions seulement fortement synergiques ou antagonistes.
Le protocole que nous décrit montre la mesure des interactions par paires ou trois voies. Un aspect essentiel du protocole est que les agents simples sont sur la même assiette que la combinaison, à minimiser le biais dû aux variations de la plaque. Par conséquent, le protocole peut être réglé pour mesurer les interactions jusqu'à 7 voies combinaisons par des modifications triviales. Combinaisons de médicaments plus de 7, il faudra plus d’une microplaque 96 puits et d’autres considérations doivent être prises pour assurer l’intégration des données correctes, comme inter inter-plaques réplicats.
Une restriction notable de la méthode diagonale est la restriction que chaque médicament à l’essai doit inhiber le phénotype d’intérêt. Par conséquent, la méthode diagonale n’est pas utile pour la compréhension des interactions entre les principes actifs et adjuvants inertes. Ces interactions « potentialisateurs » peuvent être étudiées sous des modèles alternatifs tels que les modèles Bliss ou plus élevé en monothérapie.
Une considération importante pour l’analyse des interactions médicamenteuses de poids fort est le choix de modèle nul pour les « IC50 attendu ». Lorsqu’on combine les deux médicaments, effet de la combinaison ne peut être comparé aux effets des drogues simples. Lorsque trois médicaments sont combinés, effet de la combinaison peut être comparé à effets seul ou par paire. Par exemple, si toutes les combinaisons deux à deux des trois médicaments sont synergiques, alors on peut escompter que ces médicaments montreront une synergie de trois voies. Déviation par rapport d’une interaction de trois voies à ce qui est attendu d’interactions par paire a été récemment surnommée « interaction émergente »16,17. Pour plus de simplicité, notre protocole décrit la mesure de trois voies combinaison « net interactions » qui définit le modèle nul comme les effets des médicaments seul. Toutefois, les données qui sont obtenues à partir du protocole peuvent également servir à calculer l’interaction émergente de la combinaison de trois voies. Dans notre analyse, nous avons défini l’IC50 attendue de la combinaison de trois voies comme la moyenne de la drogue unique IC50s. Par ailleurs, la CI50 attendue peut être définie comme la moyenne de la IC50s de combinaisons par paires (~1.1-1.2). L’IC50 observée est divisée par cette alternative IC50 attendue, la FIC obtenu fournit la FIC émergente pour la combinaison de trois voies, comme précédemment décrit12. Cet examen révèle que LEV + NAL + PNG est plus synergique que ce qui devrait partir des interactions par paires parmi trois médicaments, démontrant que LEV + NAL + PNG a synergie émergente.

Combinaisons de médicaments peuvent présenter un effet étonnamment élevé ou bas sur un phénotype étant donné les effets des médicaments constitutifs, correspondant à des interactions synergiques ou antagonistes drogue, respectivement1,2,3. L’utilisation de combinaisons synergétiques peut permettre à doses progressives pour l’augmentation de l’efficacité et la réduction de la dose pour le soulagement des effets secondaires. Traitements combinés peuvent également s’appliquer plusieurs revers de la machinerie cellulaire, bloquant ainsi les mécanismes potentiels d’évasion évolutive à résistance4. Donc, combinaisons de trois ou plusieurs médicaments servent régulièrement à l’agent pathogène ou cancer du traitement5.
Synergie et antagonisme sont définis par une comparaison entre l’effet observé d’une combinaison contre un effet attendu, compte tenu des effets des médicaments individuels. Parmi les modèles d’interactions médicamenteuses, Loewe additivité est le plus rigoureux et dispose d’un modèle bien défini nullFigure 1)6 (), et l’interaction de synergie/antagonisme inféré est indépendante de la concentration du médicament utilisée 6 , 7. Toutefois, le modèle Loewe est expérimentalement coûteux même pour un test d’interaction par paire. Essais d’interaction médicamenteuse se composent traditionnellement d’une matrice 2D de concentration des associations de médicaments (un essai de damier) ()Figure 2). Si 5 doses sont utilisés pour chaque médicament, 25 combinaisons sont nécessaires, correspondant à un semestre d’une microplaque si des expériences sont menées à répliquer. Le coût de cette approche interdit la mesure de la synergie par le modèle d’additivité Loewe pour les combinaisons de plusieurs médicamentsFigure 3) (). Par exemple, pour tester une interaction 10 broches, méthodes traditionnelles nécessiterait plus de 100 mille microplaques, sauf mesure expérimentale des synergies d’ordre élevé par le modèle d’additivité Loewe strict, bien sous-jacents et concentration indépendante 8.
Les traitements cliniques actuels utilisent seulement une fraction des associations médicamenteuses possibles. Par exemple, le traitement standard de tuberculose évolutive est une combinaison de trois antibiotiques. Il y a environ 20 antibiotiques utilisés dans le traitement de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Il y a 1140 combinaisons de 3 voies possibles parmi 20 médicaments, chacune avec la possibilité d’avoir une forte synergie contre VTT. Comme il n’y a eu aucune méthode rentable pour mesurer les interactions entre plusieurs médicaments, sauver la vie des combinaisons synergétiques restent non testés.
Nous décrivons ici un protocole simple permettant de mesurer les deux à deux et trois voies interactions par échantillonnage seulement la diagonale d’un test de damier ()Figure 4 et Figure 5). Le concept sous-jacent de l’échantillonnage de la diagonale d’une experience en damier a été théorisé par Berenbaum dans son ouvrage en 1978,9. Encore, cette approche a été appliquée seulement récemment à drogue synergy écrans10,11,12. Nous présentons notre protocole avec Escherichia coli (e. coli) et le phénotype de la croissance. Cependant, nous notons que le protocole est indépendant de l’espèce biologique et le phénotype d’intérêt et par conséquent peut être appliqué à la mesure de la synergie de la drogue d’ordre élevé dans d’autres contextes biologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Une combinaison synergique de médicament a une efficacité supérieure par rapport aux effets des médicaments individuels. Essais de damier, où les médicaments sont combinés à des doses beaucoup, permettent de mesurer sensible des interactions médicamenteuses. Cependant, ces essais sont coûteuses et n’évoluent pas bien pour mesurer les interactions entre plusieurs médicaments. Plusieurs études récentes ont rapporté dosage des interactions médicaments auprès d’un échantillon de diagonal d’obtenir un damier traditionnel. Cette méthode alternative a considérablement réduit le coût des expériences d’interaction médicamenteuse et permet la mesure d’interaction pour les combinaisons avec de nombreux médicaments. Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer les trois interactions par paires et une interaction de trois voies entre trois antibiotiques en double exemplaire, en cinq jours, à l’aide de seulement trois Microplaque 96 puits et matériel de laboratoire standard. Nous présentons des résultats représentatifs, montrant que la combinaison de trois antibiotiques de la lévofloxacine, l’acide nalidixique + pénicilline G est synergique. Notre protocole évolue vers le haut afin de mesurer les interactions entre plusieurs médicaments et dans d’autres contextes biologiques, permettant des écrans efficaces des synergies de plusieurs médicaments contre les agents pathogènes et les tumeurs.

Auparavant, nous avons rapporté les interactions par paires parmi trois médicaments : LEV, NAL et PNG reposant sur des tests dans des tests miniaturisés damier, où les deux médicaments ont été regroupées dans une 4x4 matrice13,14. NAL et LEV étaient synergiques, PNG a été signalé à être antagoniste avec LEV et NAL13,14. Ici, nous avons vérifié ces interactions par paires et mesurer l’interaction de trois voies entre ces trois médicaments à l’aide d’un test de diagonal. Nos résultats démontrent que LEV + NAL + PNG est une association d’antibiotiques 3 voies synergique. Les représentations schématiques pour les résultats des sections individuelles de procédure expérimentale ont été données sur le côté droit de la Figure 7 et Figure 8. Nous présentons ici et d’interpréter les résultats bruts représentatifs de trois lectures de plaque, qui sont donnés à la Figure 9. La lecture de la plaque supérieure correspond à une dilution en série et linéaire expériences menées aux étapes 2 et 3. Les lectures de plaque deux bas sont plaques double interaction réalisées à l’étape 4.
Les données brutes à la Figure 9 montrent qu’épigées sont d’environ 0,55, mais il y a une densité optique 0,05 des médias lui-même, tel qu’observé dans l' OD600 des concentrations élevées de médicaments où il n’y a pas de croissance. Par conséquent, nous définissons l’IC50 comme (0.55-0.05)/2 = 0,25. Pour chaque dose-réponse, les puits situés le plus près possible de cette valeur sont affichés avec orange.
La moitié supérieure de la Figure 9 montre les résultats de l’étape 2, expérience de série dose-réponse. Les puits d’IC50 pour LEV est à répétitions de 10 en deux colonnes, qui correspondent à 4 ng/mL. La CI50 pour NAL et PNG sont à 3 µg/mL et 25 µg/mL, respectivement. Ces concentrations correspondent à la concentration de 1 x illustrée à la Figure 7 b. La moitié inférieure de la Figure 9 montre les résultats de l’étape 3, expériences linéaire dose-réponse. LEV, NAL et IC50 de PNG sont trouvent à 0,4 x, x 0,8 et 1,2 x, respectivement. Ces concentrations sont affectées comme la 1 X IC50 pour l’étape 4.
Deux plaques correspondant à reproduire deux expériences sont indiquées dans la Figure 9 b, où l’IC50 puits sont indiqués avec orange. En plaque 1, tous les médicaments simples ont leurs IC50 à concentration de 1 x. L’IC50 attendus pour la combinaison deux à deux ou trois voies est calculé par la moyenne arithmétique des médicaments constitutifs, faisant IC50 attendus pour la concentration d’également 1 x toutes les combinaisons. En plaque 2, LEV et PNG ont leurs IC50 à la concentration de 1 x, mais NAL IC50 est à 1,2 x. La CI50 attendus pour chaque combinaison est définie à l’aide de la moyenne arithmétique de ces valeurs d’IC50. Par exemple, la CI50 attendus pour LEV + NAL et NAL + PNG est de 1,1 x. L’interaction médicamenteuse score (FIC) pour chaque combinaison est calculé en divisant observé IC50 avec l’IC50 attendus, comme indiqué sur le côté droit des plaques. Inspection des scores des deux plaques FIC montre que LEV + NAL et LEV + NAL + PNG sont synergiques, tandis que LEV + PNG et NAL + PNG sont antagonistes. Notes FIC obtenues dans les deux plaques sont en accord, soutenant la fiabilité du protocole.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figure 1 : Null définition de modèle pour le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. 5 x deux 5 matrices sur une microplaque, où le médicament A augmente linéairement dans un axe comme illustré à gauche, et une concentration supérieure de drogue inhibe un phénotype quantifiable (en haut à droite). L’ajout de ces matrices est montré dans le milieu, où les lignes de raccordement aussi puissante drogue une concentration dans chaque seul médicament ont la même concentration que la drogue A. Lorsque les cellules sont ajoutées sur ce « damier » concentration des associations de médicaments, il est prévu que le phénotype enregistré sur cette ligne sera équivalent pour les puits, qu'il se connecte. Dans cette expérience d’interaction de drogue auto-auto, l’isobole représentant un phénotype (indiqué par une ligne pointillée verte) devrait être linéaire, définissant le modèle nul de l’additivité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figure 2 : interactions de médicaments par paire selon le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. Lorsque les deux médicaments sont combinés dans un essai de damier comme dans la Figure 1, le contour de l’isophenotypic observée peut être droit, convexe ou concave. A droite, isophenotypic possible des contours (pointillés verts) sont superposent sur les dosages de damier. Combinaisons de médicaments avec des contours isophenotypic droites sont additives Loewe, comme les contours ne sont pas différents des interaction médicamenteuse auto-auto, qui est Loewe-additif par définition. Lorsque le contour de l’isophenotypic est nettement concave ou convexe, la combinaison est synergique ou antagoniste, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figure 3 : interactions médicamenteuses trois voies selon le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. Comme pour le dosage de damier d’interactions par paires, trois médicaments sont combinés dans une grille 3D (un « checkercube »), où chaque médicament augmente linéairement dans un seul axe. Si les trois médicaments étaient identiques, la surface d’isophenotypic devrait être plat, définissant l’additivité pour trois combinaisons de médicaments. Si la surface est plus concave ou convexe que ce modèle nul Loewe-additif, combinaisons de médicaments sont synergiques ou antagonistes, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figure 4 : méthode diagonale pour mesurer les interactions médicamenteuses par paires. Pour chaque essai de damier, seules les régions montrées en magenta rectangles sont mesurées. i et ii augmentons linéaire des concentrations du médicament seul. III est évaluée en faisant un mélange 1:1 des deux médicaments et titration linéairement ce mélange comme si c’était un seul médicament. La FIC est égale à l’IC50 observée dans la combinaison divisée par l’IC50 attendue de deux médicaments simples. Pour le modèle d’additivité de Loewe, l’IC50 attendue est approximée par la CI50 moyenne de ces deux médicaments seul. Une valeur FIC vaut 1 pour les paires de Loewe-additif et est inférieure ou supérieure à 1 pour les paires synergiques ou antagonistes, respectivement2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figure 5 : diagonale méthode pour mesurer les trois interactions. Pour chaque dosage checkercube, seules les régions montrées sont mesurées. i, ii et iii augmentons linéaire des concentrations du médicament seul. IV est mesurée en faisant un 1:1:1 mélange de trois médicaments et titration linéairement ce mélange comme s’il s’agissait d’un seul médicament. La Concentration inhibitrice fractionnaire est égale à l’observé IC50 dans la combinaison divisée par la CI50 attendue compte tenu de trois médicaments seul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figure 6 : flux de travail pour la méthode diagonale du protocole décrit ci-après et les détails de configuration pour chaque microplaque. La plaque figure à jour 4 est réalisée en double exemplaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figure 7 : les expériences de relation dose-effet de dilution en série et linéaire. (A) préparation des dilutions dose-réponse pour un médicament et les concentrations de médicament final correspondantes. Cellules d’Escherichia coli sont ajoutés à la plaque ; la croissance est enregistrée après 16 h. Serial IC50, montré à orange, a été sélectionné pour chaque drogue pour utilisation dans le lendemain de linéaire les expériences de relation dose-effet de dilution. (B) préparation de dilution linéaire dose-réponse pour un médicament et les concentrations de médicament final correspondantes. Cellules d’Escherichia coli sont ajoutés à la plaque ; la croissance est enregistrée après 16 h. Pour chaque médicament, le IC50s sélectionnés qui seront utilisés dans le lendemain drug interaction expériences sont indiqués en orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figure 8 : expériences d’interaction de drogue. Préparation des expériences d’interaction est semblable au seul médicament linéaire dose-effet, sauf que 1:1 ou 1:1:1 mélange de médicaments est utilisée pour deux ou trois médicament doses-réponses, respectivement. Observé IC50s pour chaque dose-réponse, représenté en orange, sont utilisées pour calculer les scores de la FIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figure 9 : représentant expérimenter résultats. Représentant résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont présentés, avec des précisions dans le texte principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Méthode diagonale à mesure synergie entre n’importe quel nombre de médicaments

Dans ce protocole, nous décrivons comment faire Loewe mesures interaction médicament axée sur l’additivité pour pairwise et combinaisons de trois médicaments.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

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