Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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Diese Arbeit wurde von NIGMS Grant P50GM107618 finanziert. Die Autoren danken für die hilfreichen Kommentare und Anregungen zum Manuskript Zohar B. Weinstein.

Hinweis: Jedes kleines Molekül, das Wachstum von E. Coli Bakterien hemmt die Diagonale Methode einsetzbar. In diesem Protokoll, Levofloxacin (LEV), wird Nalidixic Säure (NAL) und Penicillin G (PNG) als Beispiel verwendet, da diese Medikamente eine auffallende Dreiwege Synergie zeigen. Der Workflow dieses Protokolls wird als Abbildung 6dargestellt. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Verwenden Sie frische Aliquote von Bakterien und Drogen jeden Tag. Führen Sie das Experiment unter Biosafety Niveaus geeignet für E. Coli.
1. vorbereitende Schritte
<ol><li>Bereiten Sie Luria-Bertani (LB) Medien zu, indem Sie 1 L destilliertes Wasser 25 g LB Brühe hinzufügen und mischen. Autoklaven bei 121 ° C für 15 min und autoklaviert Medien bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie E. Coli Glycerin Bestände durch Mischen gleiche Volumina von sterilen 50 % Glycerin und Bakterienzellen verdünnt auf OD600 = 1 in LB Brühe und Einfrieren 150 µL-Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei-80 ° C.</li>
	<li>20 mg Antibiotika, LEV, NAL und PNG in 1 mL jedes Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen. Verdünnen Sie LEV Lösung 100 X 0,2 µg/ml durch das Mischen von 10 µL LEV-Lösung mit 990 µL von DMSO. Verwenden Sie 0,2 mg/mL LEV und 20 mg/mL NAL und PNG in den Schritten fortfahren.</li>
	<li>Aliquoten 50 µL jedes Antibiotikum 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Einfrieren bei-20 ° C.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 150 µL aliquoten von E. Coli von-80 ° C. Tauwetter.</li>
	<li>100 µL der E. Coli -Glycerin-Lager in 5 mL LB Medien in einem 14 mL Kultur Rohr hinzufügen.</li>
	<li>Schütteln Sie die Rohre in einem Inkubator 37 ° C über Nacht bei 200 u/min.</li>
</ol>2. serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment
<ol><li>Nehmen Sie eine Aliquote Drogen LEV, NAL und PNG von-20 ° C, lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 10 min Auftauen und bereiten für serielle Verdünnungen dieser Medikamente.</li>
	<li>Bereiten Sie 1100 µL LB - 10 % Sol durch das Mischen von 990 µL LB Medien und 110 µL des Lösungsmittels (DMSO).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 µL LB - 10 % LEV durch das Mischen von 450 µL LB Medien und 50 µL der LEV.</li>
	<li>Vortex LB - 10 % Sol für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die obersten vier Reihen von Brunnen in einer 96-Well-Mikrotestplatte 20 µL LB - 10 % Sol hinzufügen.</li>
	<li>Vortex LB - 10 % LEV für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die erste Bohrung in Zeile A. 20 µL LB - 10 % LEV hinzufügen</li>
	<li>Wappnen Sie zweifach serielle Verdünnung für LB - 10 % LEV 20 µL aus dem ersten Brunnen, hinzufügen zum zweiten Brunnen, nach oben und unten fünfmal pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Brunnen gegenüber dem Vorquartal bis 11. gut, endet mit 40 µL (Abb. 7A).</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie 20 µL des Inhalts vom 11. gut, mit einer Mikropipette.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für die Drogen NAL und mit der zweiten und dritten Zeilen der Mikrotestplatte bzw. PNG.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für das Medikament LEV am vierten Zeile wieder als interne positive Kontrolle.</li>
	<li>Mit einem Spektralphotometer messen die OD600 eine 01:10 Verdünnung der Kultur (Stufen 1,5-1,7).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir.</li>
	<li>Mit einem Mehrkanal-mikropipette, 80 µL der verdünnten Zellen fügen Sie hinzu, die Droge serielle Verdünnungen in Schritt 2,4-2,9 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7Agezeigt. Versiegeln Sie die Platte, um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c</li>
	<li>Starten Sie eine neue Bakterienkultur im Schritt 3 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7).</li>
</ol>3. lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment
<ol><li>Messen Sie die OD600 Extinktion für serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Platte aus Schritt 2 mit einem Teller Reader (Abbildung 7A Rechts) zu und interpretieren Sie der Ergebnisse anhand der folgenden Schritte.</li>
	<li>Normalisieren Sie das Wachstum zu, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum in der keine Doping-Kontrolle für jede Zeile und berechnen Sie Prozent Wachstum durch die Normalisierung der OD600bis kein Medikament Zustand zu.</li>
	<li>Suchen Sie für jedes Medikament die Brunnen, die Wachstumshemmung ~ 50 % (IC50) in Orange in Abbildung 7A richtigdargestellt haben. Weisen Sie die Konzentration in diesen Brunnen als "serielle IC50" für jedes Medikament.</li>
	<li>Tauen Sie frischen Droge Aliquote, bereiten Sie 1 mL LB - 10 % Sol durch Mischen LB Medien und Lösungsmittel (DMSO) in einem Verhältnis von 9:1 und LB - 10 % Droge durch Mischen von LB Medien und Droge im Verhältnis 9:1, wo die Wirkstoffkonzentration 100 X serielle IC50 jedes Medikament ist vor dem Hinzufügen der LB Medien , wie bei Schritt 3.3 gewählt.</li>
	<li>Bereiten Sie Linear steigende Dosen von Medikamenten LEV, NAL und PNG in 11 Konzentrationen durch Mischen LB - 10 % Drogen- und LB - 10 % Sol in Mengen, die in Abbildung 7gezeigt.</li>
	<li>Bereiten Sie Linear steigende Dosen von LEV am vierten Zeile als eine interne Positivkontrolle.</li>
	<li>Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kultur begann im Schritt 2.14.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir.</li>
	<li>Fügen Sie 80 µL der verdünnten Zellen auf die Droge lineare Verdünnungen im Schritt mit einem Mehrkanal-Mikropipette 3.6 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7 bgezeigt. Hinweis: Die Mitte in der Dosis-Wirkungs-erhalten die serielle IC50 für dieses Medikament. Dichtplatte um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c</li>
	<li>Starten Sie zwei frische Bakterienkulturen im Schritt 4 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7).</li>
</ol>(4) Diagonale Drug Interaction Experiment
<ol><li>Messen Sie die OD600 Extinktion für Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung von Schritt 3 (Abb. 7 b).</li>
	<li>Wählen Sie für jedes Medikament die Konzentration, die IC50 führte und bereiten Drogen LEV, NAL und PNG in 100 x IC50 Konzentrationen.</li>
	<li>Tauen Sie frische Drogen, bereiten Sie 100 x IC50 für jedes Medikament und bereiten Sie 1:1-Wirkstoff-Mischungen nach Volumen von LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und 1:1:1 Medikament Mischung Volumenprozent LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Platten auf Droge Interaktion Experimente wie in Abbildung 8dargestellt.</li>
	<li>Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kulturen im Schritt 3.11 begann.</li>
	<li>Bereiten Sie OD600 = 0,01 Verdünnungen zweier Kulturen in zwei 10 mL LB Medien.</li>
	<li>Fügen Sie 80 µL der Zellen von Kultur 1 und 2 auf Platten 1 und 2, beziehungsweise. Versiegeln Sie die Platten um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten für 16 h bei 37 ° c</li>
</ol>5. Diagonale Drug Interaction Scores
<ol><li>Maßnahme die OD600 Extinktion für Diagonale Wechselwirkungen experimentieren Platten aus Schritt 4.</li>
	<li>Das Wachstum zu normalisieren, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum keine Drogenkontrolle gut für jede Zeile.</li>
	<li>Suchen Sie für jede Zeile Spalte, die Wachstumshemmung am nächsten IC50, rechts in Orange in Abbildung 8 dargestellt hat. Ordnen Sie IC50 basierend auf die relative Konzentration des Medikaments in dieser gut zu.</li>
	<li>Für LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und LEV + NAL + PNG Dosis-Reaktionen Berechnung erwartete IC50 durch Mittelung der IC50 der einzelnen Drogen in jeder Kombination. Beachten Sie, dass im Durchschnitt eine einfache Näherung für genaue erwartete IC50-Berechnung ist wie vor12beschrieben.</li>
	<li>Berechnen Sie gebrochene inhibitorischen Konzentration (FIC) punktet durch die Aufteilung der beobachteten IC50 durch den erwarteten IC50 in jeder Kombination.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. 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M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Verwendung von Medikamenten-Kombinationen gegen Krankheitserreger oder Tumoren ist eine attraktive Perspektive, besonders unter den Umständen der Trocknung Antibiotika Pipeline. Allerdings ist dieses Potenzial durch mindestens zwei Schwierigkeiten behindert. Die erste Schwierigkeit ist die astronomische Zahl der möglichen Kombinationen. Zum Beispiel gibt es 4950 paarweisen Kombinationsmöglichkeiten unter 100 Antibiotika. Alle möglichen Kombinationen unter 100 Antibiotika (2100) ist auf der gleichen Größenordnung mit der Anzahl der Bakterien auf der Erde (~ 10-30). Wie stark synergistische Kombinationen aus diesen Möglichkeiten vorhergesagt wurde Gegenstand zahlreicher rechnerische Untersuchungen. Die zweite Schwierigkeit ist die Messung der höchstwertige Arzneimittel-Wechselwirkungen. Der Auffassung, dass eine rechnerische Plattform darauf hindeuten könnte, dass eine bestimmte 10-Wirkstoff-Kombination gegen einen bestimmten Erreger stark synergistisch ist. Traditionelle Methoden, Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu testen ist zu teuer, zu überprüfen oder zu widerlegen diese Hypothese, daher wurde das Studium der Synergie zwischen viele Medikamente außerhalb der Grenzen der wissenschaftlichen Untersuchung. Die Diagonale Methode, die wurde vor fast 30 Jahren vorgeschlagen und wurde in den letzten Synergie-Bildschirmen verwendet bieten ein starkes Fundament für das erste Problem, indem es erlaubt, Prüfung von der Interaktion zwischen den vielen Paaren. Es löst das zweite Problem durch eine informative Probenahme von der traditionellen Assays und ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige.
Wir beachten wichtig ist, dass unser Protokoll eine lineare Dosierung für Droge Interaktion Messungen verwendet für die Empfindlichkeit zur Erkennung von gar schwachen Wechselwirkungen. Festlegung des richtigen Konzentrationsbereichs für lineare Dosierung ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Durch die erste Durchführung eine serielle Verdünnung, machen wir eine fundierte Entscheidung über den Suchraum für lineare Dosierung. Aber das Protokoll kann geändert werden, um 2-fach verwenden oder höhere Verdünnungsreihen für Drogen-Interaktion zu testen. Eine solche Änderung würde das Experiment zu verkürzen und ermöglichen das Testen von mehr Interaktionen; Allerdings hätte es Sensibilität zu nur stark synergistische oder antagonistische Interaktionen zu erkennen.
Das Protokoll, die, das wir beschrieben, zeigt die Messung der paarweisen oder Dreiwege Interaktionen. Ein kritischer Aspekt des Protokolls ist, dass einzelne Agenten auf der gleichen Platte als Kombination, um Verzerrung aufgrund Platte Variationen zu minimieren. Daher kann das Protokoll angepasst werden um Interaktionen bis zu 7-Wege-Kombinationen zu messen durch triviale Änderungen. Kombinationen von mehr als 7 Medikamenten erfordert mehr als eine 96-Well Mikrotestplatte und weitere Überlegungen getroffen werden, um korrekte Datenintegration, wie zwischen den Platten Wiederholungen zu gewährleisten.
Eine nennenswerte Einschränkung der Diagonale Methode ist die Einschränkung, dass jedes Medikament in der Probe muss den Phänotyp von Interesse zu hemmen. Daher ist die Diagonale Methode nicht hilfreich für das Verständnis der Interaktionen zwischen den Wirkstoffen und inerte Adjuvantien. Solche "potenzierende" Wechselwirkungen können unter alternative Modelle wie Glückseligkeit oder höchsten Einzelsubstanz Modelle untersucht.
Ein wichtiger Aspekt für die Analyse von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige eignet sich null Modell für "erwartet, die IC50." Wenn zwei Medikamente kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung nur auf die einzelnen Drogenwirkungen verglichen werden. Wenn drei Medikamenten kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung auf die einzelnen paarweise Auswirkungen oder verglichen werden. Zum Beispiel wenn alle paarweise Kombinationen der drei Medikamente synergistische sind, dann es zu rechnen, dass diese Medikamente eine drei-Wege-Synergie zeigen werden. Eine drei-Wege-Interaktion Abweichung von paarweisen Interaktionen Erwartungen hat vor kurzem "emergent Interaktion"16,17genannt. Der Einfachheit halber beschreibt unser Protokoll die Messung der drei-Wege-Kombination "net Interaktion," die null Modell als einziges Medikament Auswirkungen definiert. Die Daten, die von dem Protokoll vorliegt können jedoch auch verwendet werden, um die emergent Interaktion der drei-Wege-Kombination zu berechnen. In unserer Analyse haben wir die erwartete IC50 der Dreiwege Kombination als der Durchschnitt der einzelnen Droge IC50s definiert. Alternativ können die erwarteten IC50 als Durchschnitt der IC50s der paarweisen Kombinationen (~1.1-1.2) definiert werden. Wenn die beobachteten IC50 durch diese alternative erwarteten IC50 geteilt wird, bietet der erhaltenen FIC emergent FIC für die drei-Wege-Kombination als zuvor beschriebenen12. Diese Überlegung zeigt, dass LEV + NAL + PNG mehr ist als was man erwarten würde von paarweisen Interaktionen zwischen drei Medikamente, synergistische zeigt, dass LEV + NAL + PNG emergent Synergie hat.

Wirkstoffkombinationen können überraschend hohe oder niedrige Auswirkung auf einen Phänotyp angesichts der Auswirkungen der konstituierenden Drogen, entsprechend synergistisch oder antagonistisch Arzneimittelinteraktionen, bzw.1,2,3aufweisen. Synergistische Kombinationen können Dosissteigerung zur Erhöhung der Wirksamkeit und Dosisreduktion für Nebenwirkung Relief. Kombinationstherapien können auch mehrere Rückschläge auf zellulären Maschinerie, dadurch blockiert mögliche evolutionäre Fluchtmechanismen Widerstand4anwenden. Daher sind Kombinationen von drei oder mehr Medikamenten Krankheitserreger oder Krebs Behandlung5routinemäßig eingesetzt.
Synergie und Antagonismus werden durch einen Vergleich zwischen den beobachteten Effekt einer Kombination im Vergleich zu einem erwarteten Wirkung gegeben einzelnen Drogenwirkungen definiert. Unter den Modellen für Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten Loewe Additivität ist die strengste und hat ein klar definiertes null Modell ()Abbildung 1()6, und die abgeleitete Synergie/Antagonismus Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Konzentration der Droge 6 , 7. Loewe Modell ist jedoch auch für einen paarweisen Wechselwirkung Test experimentell kostspielig. Droge Interaktion Assays bestehen traditionell aus einer 2D-Matrix Wirkstoffkombinationen Konzentration (ein Schachbrett-Assay) ()Abbildung 2(). Wenn 5 Dosen sind für jedes Medikament verwendet, dann 25 Kombinationen erforderlich sind, entspricht eine Hälfte einer Mikrotestplatte wenn Experimente in Wiederholung durchgeführt werden. Die Kosten für diesen Ansatz verbietet Synergie Messung vom Loewe Additivität Modell für Multi-Wirkstoffkombinationen ()Abbildung 3(). Zum Beispiel um eine 10-fach-Interaktion zu testen, müsste traditionelle Methoden mehr als 100 Tausend Mikroplatten, abgesehen von experimentellen Messung von höherwertigen Synergien durch das strenge, gut theoretisiert und Konzentration-unabhängige Loewe Additivität Modell 8.
Aktuelle klinische Behandlungen nutzen nur einen Bruchteil der möglichen Medikamenten-Kombinationen. Die standard-Behandlung von aktiver Tuberkulose ist beispielsweise eine Kombination aus drei Antibiotika. Es gibt etwa 20 Antibiotika in Mycobacterium Tuberculosis (Mtb) Behandlung verwendet. Es gibt 1140 3-Wege-Kombinationen unter 20 Medikamente, jeweils mit dem Potenzial, eine starke Synergie gegen Mtbhaben. Da gab es keine kostengünstige Methode zur Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu viele Drogen, bleiben potentiell lebensrettende synergistische Kombinationen ungetestet.
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Messung der paarweisen und Dreiwege Arzneimittel-Wechselwirkungen durch Stichproben nur die Diagonale von einem Schachbrett-Assay ()Abbildung 4 und Abbildung 5(). Das zugrunde liegende Konzept der Probenahme die Diagonale von einem Schachbrett-Experiment wurde von Berenbaum in seiner bahnbrechenden Arbeit in 19789theoretisiert. Dieser Ansatz wurde jedoch erst vor kurzem auf Droge Synergie Bildschirme10,11,12angewendet. Wir präsentieren unser Protokoll mit Escherichia coli (E. Coli) und dem Wachstum Phänotyp. Wir beachten Sie jedoch, dass das Protokoll unabhängig von der biologischen Arten und Phänotyp von Interesse, und daher auf die Messung von höherwertigen Droge Synergie in anderen biologischen zusammenhängen angewendet werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Eine synergetische Wirkstoffkombination hat eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu den Auswirkungen der einzelnen Drogen. Schachbrett-Assays, wo Drogen in viele Dosen verbunden sind, können empfindliche Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten. Aber diese Assays sind teuer und nicht gut für die Messung der Interaktion zwischen den vielen Medikamenten skalieren. Mehrere neuere Studien berichteten Droge Interaktion Messungen mittels eine Diagonale Probenahme von den traditionellen Schachbrett-Assay. Diese alternative Methode erheblich verringert die Kosten der Droge Interaktion Experimente und ermöglicht Interaktion Messung für Kombinationen mit vielen Medikamenten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der drei paarweisen Interaktionen und ein Dreiwege Interaktion zwischen drei Antibiotika in zweifacher Ausfertigung, in fünf Tagen, mit nur drei 96-Well-Mikroplatten und standard Laborgeräten. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die drei-Antibiotikum-Kombination von Levofloxacin + Nalidixic Säure + Penicillin G synergistische ist. Unser Protokoll verkalkt, um Interaktionen zu viele Drogen und in anderen biologischen zusammenhängen ermöglicht effiziente Bildschirme für Multi-Drug Synergien gegen Krankheitserreger und Tumoren zu messen.

Bisher haben wir die paarweisen Interaktionen zwischen drei Drogen berichtet: LEV, NAL und PNG basierend auf Tests in miniaturisierten Schachbrett-Assays, wo zwei Drogen wurden in einem 4 x 4-Matrix13,14kombiniert. NAL und LEV synergistische waren, wurde PNG berichtet, antagonistischen mit NAL und LEV13,14. Hier, wir überprüft diese paarweisen Interaktionen und die Dreiwege Interaktion zwischen diesen drei Medikamente mit einem diagonalen Assay gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LEV + NAL + PNG eine synergistische 3-Wege-Antibiotika-Kombination. Schematische Darstellungen für die Ergebnisse der einzelnen Versuchsdurchführung Abschnitte erhielten auf der rechten Seite von Abbildung 7 und Abbildung 8. Hier präsentieren wir und interpretieren repräsentative raw Ergebnisse aus drei Lesungen, Platte, die in Abbildung 9gegeben sind. Die obere Platte Lesung entspricht serielle und lineare Verdünnung Experimente in den Schritten 2 und 3. Die unteren zwei Teller Lesungen sind doppelte Interaktion Platten in Schritt 4 durchgeführt.
Die Rohdaten in Abbildung 9 zeigt, dass Wachstum um 0,55, aber es eine 0,05 optische Dichte des Mediums selbst gibt, wie in der OD600 der hohen Wirkstoff-Konzentrationen beobachtet wo gibt es kein Wachstum. Daher definieren wir als IC50 (0.55-0.05)/2 = 0,25. Für jede Dosis-Wirkungs-sind die Brunnen befindet sich am nächsten an diesem Wert mit Orange angezeigt.
Die obere Hälfte der Abbildung 9A zeigt die Ergebnisse aus Schritt 2, serielle Dosis-Wirkungs-Experiment. Die IC50 Wells für LEV ist in Spalte 10 in zwei Wiederholungen, die 4 ng/mL entsprechen. Die IC50 für NAL und PNG sind 3 µg/mL und 25 µg/mL, beziehungsweise. Diese Konzentrationen entsprechen 1 X-Konzentration, die in Abbildung 7gezeigt. Die untere Hälfte der Figur 9 zeigt die Ergebnisse aus Schritt 3, lineare Dosis-Wirkungs-Experimente. LEV, NAL und PNG IC50 befinden sich 0,4 x 0,8 x und 1.2 X, beziehungsweise. Diese Konzentrationen sind als 1 X IC50 für Schritt 4 zugewiesen.
Zwei Platten entspricht zwei replizieren, die Versuche sind in Abbildung 9 b, wo die IC50 Brunnen gezeigt werden in Orange angezeigt. Ihre IC50 stehen alle einzelnen Drogen in Platte 1 1 X Konzentration. Die erwarteten IC50 für die paarweise oder Dreiwege Kombination errechnet sich durch das arithmetische Mittel der konstituierenden Drogen machen erwarteten IC50 für alle Kombinationen auch 1 X Konzentration. In Platte 2, LEV und PNG haben ihre IC50 bei 1 X Konzentration, aber NAL IC50 ist bei 1,2 X. Die erwarteten IC50 für jede Kombination wird über das arithmetische Mittel dieser IC50-Werte definiert. Beispielsweise ist die erwartete IC50 für LEV + NAL und NAL + PNG 1.1 X. Die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten Punkten (FIC) für jede Kombination dividiert wird beobachtet IC50 mit der erwarteten IC50 wie auf der rechten Seite der Platten dargestellt. Inspektion der FIC Partituren der beiden Platten zeigt, dass LEV + NAL und LEV + NAL + PNG synergistische, während LEV + PNG und NAL + PNG feindselig sind. FIC Partituren erwarb die beiden Platten sind sich einig, die Zuverlässigkeit des Protokolls zu unterstützen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Abbildung 1: Null Modelldefinition für Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Zwei 5 x 5 Matrizen auf einer Mikrotestplatte Medikament A steigt linear in einer Achse, wie links gezeigt, wobei eine höchste Konzentration des Arzneimittels hemmt einen quantifizierbaren Phänotyp (oben rechts). Die Zugabe dieser Matrizen zeigt sich in der Mitte, wo die Verbindungslinien zwar Medikament Konzentrationen in jedes einzelne Medikament die gleiche Konzentration als Medikament A. haben Wenn Zellen auf diese "Schachbrett" Konzentration Wirkstoffkombinationen hinzugefügt werden, wird davon ausgegangen, dass der aufgezeichneten Phänotyp auf dieser Linie werden Äquivalent für die Brunnen, die sie verbindet. In diesem selbst-selbst-Droge Interaktion Experiment soll die Isobole Darstellung eines Phänotyps (mit einer grünen gestrichelten Linie dargestellt) linear, definieren die Additivität null Modell sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Abbildung 2: paarweise Drogeinteraktionen nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Wenn zwei Medikamente in einem Schachbrettmuster Assay wie in Abbildung 1kombiniert werden, kann die beobachteten Isophenotypic Kontur gerade, konvex oder konkav sein. Auf der rechten Seite sind mögliche Isophenotypic Konturen (grün gestrichelt) Schachbrett Assays überlagert. Wirkstoffkombinationen mit geraden Isophenotypic Konturen sind Loewe-Additiv, da die Konturen nicht anders als eine selbst-selbst-Wechselwirkungen sind die Loewe-Additiv ist per Definition. Wenn die Isophenotypic Kontur deutlich konkav oder konvex ist, ist die Kombination synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Abbildung 3: Dreiwege Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Ähnlich wie bei der Schachbrett-Assay für paarweisen Interaktionen, werden drei Drogen in einem 3D Raster (ein "Checkercube"), kombiniert, wo jedes Medikament in einer Achse linear erhöht wird. Wenn die drei Medikamente identisch wären, dürfte die Isophenotypic Oberfläche flach, definieren die Additivität für drei Wirkstoffkombinationen werden. Wenn die Oberfläche konkav oder konvex als dieses null Loewe-Additiv-Modell ist, sind Wirkstoffkombinationen synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Abbildung 4: Diagonale Methode zur Messung der paarweisen Arzneimittelinteraktionen. Für jedes Schachbrett-Assay gemessen werden nur die Bereiche in Magenta Rechtecke dargestellt. i und Ii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. III wird bewertet, indem er eine 1:1 Mischung von zwei Medikamenten und Linear titrieren diese Mischung, als sei es ein einzelnes Medikament. Der FIC ist gleich der beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 zwei einzelne Medikamente. Für die Loewe-Additivität-Modell wird die erwartete IC50 durch die durchschnittliche IC50 die beiden einzigen Medikamente angenähert. Ein FIC-Wert ist 1 für Loewe-Additiv-Paare und niedriger oder höher als 1 bei synergistisch oder antagonistisch Paaren, bzw.2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Abbildung 5: Diagonale Methode zur Messung der Dreiwege Arzneimittelinteraktionen. Für jede Checkercube-Assay werden nur die abgebildeten Regionen gemessen. i, Ii und Iii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. IV wird gemessen, indem man eine 1:1:1 Mischung aus drei Drogen und Linear titrieren diese Mischung, als wäre es ein einziges Medikament. Die gebrochene inhibitorischen Konzentration entspricht den beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 drei einzelne Medikamente gegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Abbildung 6: Workflow für die Diagonale Methode Protokoll beschriebenen und Einrichtungsdetails für jedes Mikrotestplatte. Die Platte in Tag 4 dargestellte erfolgt in zweifacher Ausfertigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Abbildung 7: serielle und lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (A) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-serielle Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird aufgezeichnet, nachdem 16 h. serielle IC50, gezeigt in Orange, für jedes Medikament ausgewählt wurde, für Gebrauch in den folgenden Tag linear ist Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (B) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird nach 16 Uhr aufgezeichnet. Für jedes Medikament Medikament die ausgewählten IC50s, die am nächsten Tag verwendet werden Interaktion, die Experimente in Orange angezeigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Abbildung 8: Drug Interaction Experimente. Vorbereitung der Interaktion Experimente ist ähnlich wie einzelne Droge lineare Dosis-Antworten, außer dass eine 1:1 oder 1:1:1 Mischung von Medikamenten dient für zwei oder drei Medikament Dosis-Antworten, beziehungsweise. IC50s für jede Dosis-Antwort, abgebildet in Orange, beobachtet werden verwendet, um FIC Ergebnisse berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Abbildung 9: Vertreter experimentieren Ergebnisse. Repräsentative Ergebnisse über das beschriebene Protokoll werden mit Angaben im Haupt-Text angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonale Methode zur Maßnahme Synergie zwischen beliebig vieler Medikamente

In diesem Protokoll beschreiben wir wie Sie Loewe Additivität basierende Medikament Interaktion Messungen paarweise für und Dreiwege Medikamenten-Kombinationen.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

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