Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי גרנט NIGMS P50GM107618. המחברים תודה זהר B. וינשטיין להערות תובנה של הצעות על כתב היד.

הערה: כל מולקולה קטנה זה מעכב התפתחות חיידקים e. coli יכול לשמש עבור שיטת אלכסוני. ב פרוטוקול זה, levofloxacin (לב), חומצה nalidixic (NAL), ו פניצילין G (PNG) ישמש כדוגמה, מאז תרופות אלה להראות סינרגיה משולשת מובהקת. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצג באיור 6. לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. השתמש aliquots טריים של חיידקים, תרופות כל יום. לבצע את הניסוי תחת רמות אבטחה מתאים e. coli.
1. הכנה צעדים
<ol><li>להכין לוריא-Bertani (LB) מדיה על-ידי הוספת 25 גר' מרק LB 1 ליטר של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות וחנות המדיה בלוק בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן e. coli גליצרול מניות על ידי ערבוב נפחים שווים של גליצרול 50% סטרילי, תאים חיידקיים מדולל כדי OD600 = 1 LB מרק ומקפיאים 150 aliquots µL 1.5 mL צינורות microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפזר 20 מ ג של אנטיביוטיקה, לב, NAL ו- PNG ב- 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כל אחד. לדלל לב פתרון 100 x 0.2 µg/mL על ידי ערבוב µL 10 של פתרון לב עם 990 µL של דימתיל סולפוקסיד. השתמש 0.2 מ"ג/מ"ל לב, 20 מ"ג/מ"ל NAL ו- PNG בשלבים בהליך.</li>
	<li>Aliquot 50 µL של כל אנטיביוטיקה ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות, הקפאת ב-20 ° C.</li>
	<li>Aliquot µL לקחת 150 אחד של e. coli מ-80 מעלות צלזיוס. הפשרה.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של e. coli גליצרול מניות ב 5 מ ל LB מדיה בשפופרת תרבות 14 מ.</li>
	<li>לרעוד הצינורות 37 ° C חממה בן לילה-200 סל ד.</li>
</ol>2. טורי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>קח את אחד aliquot של סמים לב, NAL ו- PNG מ-20 ° C, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. להפשיר ולהתכונן דילולים טורי של תרופות אלו.</li>
	<li>להכין 1100 µL של סול LB - 10% על ידי ערבוב 990 µL של התקשורת LB µL 110 של הממס (דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>להכין µL 500 של לב LB - 10% על ידי ערבוב µL 450 של מדיה LB µL 50 של לב.</li>
	<li>מערבולת סול LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. הוסף 20 µL של סול LB - 10% העליון ארבע השורות של בורות מים microplate 96-ובכן.</li>
	<li>מערבולת לב LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. להוסיף 20 µL של LB - 10% לב הבאר הראשונה בשורה א</li>
	<li>היכונו דילול טורי כפולה לב LB - 10% על ידי לקיחת 20 µL מן הבאר הראשונה, הוספת הבאר השנייה, pipetting לאורך חמש פעמים. חזור על הפעולה עבור כל בארות ברצף עד ה-11 טוב, אשר בסופו עם 40 µL (איור 7 א).</li>
	<li>להסיר ולמחוק 20 µL של התוכן של ה-11, שימוש של micropipette.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 הסמים NAL ו- PNG באמצעות לשורות microplate, השני והשלישי בהתאמה.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 התרופה לב שוב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>שימוש ספקטרופוטומטרים, למדוד את יתר600 של 1:10 דילול של התרבות (שלבים 1.5-1.7).</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>שימוש של micropipette רב-ערוצי, להוסיף µL 80 של התאים מדולל דילולים טורי סמים מוכנה בשלב 2.4-2.9. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג איור 7 א. חותם את הצלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>מתחילים תרבות חדשה חיידקי לשימוש בשלב 3 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>3. ליניארי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>למדוד את ספיגת600 OD לצלחת מנה-תגובה דילול טורי משלב 2 שימוש בקורא צלחת (איור 7 א נכון) ולפרש את התוצאות בהתבסס על השלבים הבאים.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים אין עבור כל שורה ולחישוב אחוזי הצמיחה על ידי נרמול OD600למצב ללא סמים.</li>
	<li>לכל סם, אתר הבארות שיש עיכוב גדילה ~ 50% (IC50), שמוצג כתום איור 7 א נכון. הקצה את הריכוז בבארות האלה כמו "IC50 טורי" לכל סם.</li>
	<li>הפשרת סמים טרי aliquots, להכין 1 מ"ל של סול LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה הממס (דימתיל סולפוקסיד) 9:1 יחס, סמים LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה סמים על יחס 9:1, הריכוז של התרופה איפה x 100 של IC50 סדרתי של כל תרופה לפני הוספת התקשורת ליברות , כפי שבחרת בשלב 3.3.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים 11, על ידי ערבוב LB - 10% sol כרכים שמוצג באיור 7 בוהסמים LB - 10%.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של לב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבות התחיל בשלב 2.14.</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מדולל על דילולים ליניארי סמים מוכנה בשלב 3.6 באמצעות micropipette רב-ערוצי. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג באיור 7. הערה: באמצע גם המנה-תגובה יקבלו את IC50 סדרתי של הסם. חותם צלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>התחל שתי תרבויות חיידקי טריים לשימוש בשלב 4 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>4. אלכסוני סמים אינטראקציה ניסוי
<ol><li>למדוד את ספיגת600 יתר על דילול ליניארי מנה-תגובה מ שלב 3 (איור 7 ב).</li>
	<li>לכל סם, לבחור הריכוז, גרמו IC50, להכין סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים x IC50 100.</li>
	<li>הפשרת סמים טריים, היכונו 100 x IC50 עבור כל הסמים ולהכין תערובות 1:1 סמים לפי נפח של לב + NAL, לב + PNG ו- NAL + PNG ו- 1:1:1 סמים תערובת לפי נפח של לב + NAL + PNG.</li>
	<li>להכין שתי צלחות לניסויים אינטראקציה סמים כמוצג באיור8.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבויות התחיל בשלב 3.11.</li>
	<li>להכין OD600 = 0.01 דילולים של שתי תרבויות ב שני 10 מ ל LB מדיה.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מתרבות 1 ו- 2 על צלחות 1 ו- 2, בהתאמה. חותם את הצלחות כדי למנוע התאיידות. דגירה הלוחות עבור h 16 ב 37 º C.</li>
</ol>5. אלכסוני סמים אינטראקציה עם ציונים
<ol><li>למדוד ספיגת600 יתר לאינטראקציה סמים אלכסוני הניסוי צלחות משלב 4.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים לא טוב עבור כל שורה.</li>
	<li>עבור כל שורה, אתר את העמודה בעלת הצמיחה עיכוב הקרוב ביותר IC50, שמוצג כתום באיור 8 צודק. הקצה IC50 מבוסס על הריכוז היחסי של סמים בתוך הבאר הזו.</li>
	<li>לב + NAL, לב + PNG של מינון-תגובות NAL + PNG ולב + NAL + PNG, לחשב IC50 הצפוי על ידי חישוב ממוצע של IC50 של התרופות יחיד בכל שילוב. שימו לב כי בממוצע הערכה פשוטה לחישוב IC50 הצפוי המדויק כפי שתואר לפני12.</li>
	<li>לחשב ריכוז מעכבות החלקי (FIC) ציונים על-ידי חלוקת את IC50 נצפתה על ידי IC50 הצפוי בכל שילוב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השימוש של שילובים תרופתיים נגד פתוגנים או גידולים הוא פרוספקט אטרקטיבי, במיוחד בנסיבות של הצינור לאנטיביוטיקה ייבוש. עם זאת, פוטנציאל זה היא הקשו על ידי לפחות שני קשיים. הקושי הראשון הוא מספר אסטרונומי של צירופים אפשריים. לדוגמה, ישנם 4950 pairwise. צירופים אפשריים בין 100 אנטיביוטיקה. כל השילובים האפשריים בין 100 אנטיביוטיקה (2100) נמצא באותו סדר גודל הצפוי עם המספר של חיידקים על פני כדור הארץ (~ 1030). כיצד לחזות שילובים חריפה סינרגטי בין האפשרויות הללו כבר את הנושא של מחקרים רבים חישובית. הקושי השני הוא המדד של אינטראקציות בסמים גבוהים. קח בחשבון כי פלטפורמה חישובית יכול להציע כי שילוב 10-סמים מסוימים הוא סינרגטי בחריפות נגד חיידקים מסוימים. שיטות מסורתיות כדי לבדוק אינטראקציות בסמים הוא יקר מדי לאמת או להפריך השערה זו, ולכן המחקר של סינרגיה בין תרופות רבות כבר מחוץ לגבולות של חקירה מדעית. שיטת אלכסוני, אשר הועלתה לראשונה לפני כמעט 30 שנה והיה בשימוש מספר מסכי סינרגיה האחרונה מספקים בסיס חזק הבעיה הראשונה, בכך שהוא מאפשר בדיקה של האינטראקציה בין זוגות רבים. הוא פותר את הבעיה השנייה על ידי הדגימה אינפורמטיבי של מבחני המסורתי ומאפשר לימוד גבוהים תרופתיות.
חשוב לציין נציין כי הפרוטוקול שלנו משתמשת מינון לינאריים למדידות אינטראקציה עם סמים, כדי לספק את הרגישות לגילוי אפילו אינטראקציות חלשות. הקמת טווח ריכוז נכון עבור מינון לינאריים הוא משימה מאתגרת. מאת הראשון מבצע לדילול טורי, לנו לקבל החלטה מושכלת לגבי שטח החיפוש עבור מינון לינאריים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות שונה לשימוש קיפול כפול או דילולים טורי גבוה יותר עבור סמים בדיקות האינטראקציה. שינוי כזה לקצר את זמן הניסוי ולאפשר בדיקה של אינטראקציות יותר; ואולם זה אין רגישות כדי לזהות אינטראקציות רק בחום סינרגטי או עוינת.
פרוטוקול שהסברנו מציג את המדידה של אינטראקציות pairwise או משולשת. היבט חשוב של הפרוטוקול הוא אחד הסוכנים באותה צלחת כמו השילוב, כדי לצמצם הטיה בשל הבדלים צלחת. לכן, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות עד 7-הדרך שילובים על-ידי שינויים טריוויאלי. שילובים של תרופות יותר מ-7 ידרוש יותר מפעם אחת microplate 96-ובכן, שיקולים נוספים יש לנקוט כדי להבטיח שילוב הנתונים הנכונים, כגון משכפל הבין-plate.
מגבלה הבולטים של השיטה אלכסונית היא ההגבלה כי כל תרופה וזמינותו חייב לעכב את פנוטיפ של עניין. לכן, השיטה אלכסוני אינו שימושי להבנת את האינטראקציות בין סוכנים פעילים וחיסונים adjuvants אינרטי. אינטראקציות 'שמגדיל יכולתו' כזה עשויים להילמד תחת מודלים חלופיים כגון מודלים אושר או סוכן יחיד הגבוהה ביותר.
שיקול חשוב לניתוח של אינטראקציות בסמים גבוהים הוא הבחירה null מודל "מצופה IC50." כאשר שתי תרופות משולבות, האפקט של השילוב בלבד ניתן להשוות את ההשפעות התרופה יחיד. כאשר שלושת התרופות משולבות, ניתן להשוות האפקט של השילוב אפקטים בודדים או אפקטים pairwise. לדוגמה, אם כל השילובים pairwise של שלושת התרופות סינרגטי, ואז זה יש לצפות כי תרופות אלו יראה סינרגיה-כיוונית. הסטייה של אינטראקציה משולשת מה צפוי של אינטראקציות pairwise לאחרונה שכונה "אינטראקציה מתהווים"16,17. פשטות, פרוטוקול שלנו מתאר את המדידה של 3 חלקים של שילוב "נטו אינטראקציה," אשר מגדיר את המודל null השפעות סמים בכול. עם זאת, הנתונים המתקבל מהגדרת הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי לחשב את האינטראקציה מתהווה של השילוב-כיוונית. בניתוח שלנו, אנו מגדירים את IC50 הצפויה של השילוב-כיוונית כממוצע של הסם יחיד IC50s. לחלופין, IC50 צפויה יכולה להיות מוגדרת כממוצע של IC50s של שילובים pairwise (~1.1-1.2). כאשר IC50 נצפתה מחולק ב- IC50 הצפוי חלופית זו, FIC שהושג מספק את FIC מתהווים השילוב-כיוונית, כמו שתואר לעיל12. שיקול זה מגלה כי לב + NAL + PNG הוא סינרגטי יותר מאשר מה מצופה מכל האינטראקציות pairwise בין שלושת התרופות, הוכחת כי לב + NAL + PNG יש סינרגיה מתהווה.

שילובים תרופתיים ייתכן שיישומים השפעה מפתיעה גבוה או נמוך על הפנוטיפ נתון להשפעות של סמים המרכיבים אותה, המתאים סינרגטי או אויבת תרופתיות, בהתאמה1,2,3. השימוש של שילוב סינרגטי עשוי לאפשר המינון להגדלת היעילות וצמצום במינון להקלה לוואי. שילוב הטיפולים עשוי לחול גם עיכובים מרובים למכונאות הסלולר, ובכך חוסם מנגנוני הבריחה אבולוציונית פוטנציאל ההתנגדות4. לכן, שילובים של שלושה או יותר תרופות משמשים באופן שגרתי פתוגן או סרטן הטיפול5.
סינרגיה, אנטגוניזם מוגדרים על-ידי השוואה בין השפעת שילוב לעומת אפקט הצפויה בהתחשב סמים בודדים תופעות שנצפו. בין המודלים תרופתיות, לואי additivity היא המחמירה והקפדנית ביותר יש מודל null מוגדרים היטב (איור 1)6ואת האינטראקציה סינרגיה הנגזרת/אנטגוניזם אינו תלוי ריכוז התרופה בשימוש 6 , 7. לעומת זאת, המודל Loewe היא השפעול יקר אפילו עבור מבחן pairwise אינטראקציה. מבחני אינטראקציה סמים באופן מסורתי המרכיבים של מטריצה דו-ממדית של שילובים תרופתיים ריכוז (וזמינותו לוח שחמט) (איור 2). 5 מנות משמשים עבור כל סם, אם 25 שילובים נדרשים, התואם לאחד מחצית microplate אם מתבצעות בשכפול. העלות של גישה זו אוסרת על סינרגיה מדידה לפי מודל additivity Loewe עבור שילובי סמים רב (איור 3). לדוגמה, כדי לבדוק את האינטראקציה של 10-way, שיטות מסורתיות ידרוש יותר מ 100 אלף microplates, ולסיסמא מדידה ניסיוני של סינרגיה גבוהה-הזמנה לפי מודל additivity Loewe מחמירים, theorized היטב, שאינו תלוי-ריכוז 8.
טיפולים קליניים שוטפים מנצלים רק שבריר של שילובים תרופתיים אפשרי. לדוגמה, הטיפול הסטנדרטי של שחפת פעילה הוא שילוב של שלושה אנטיביוטיקה. ישנם כ 20 אנטיביוטיקה המשמשים לטיפול שחפת Mycobacterium (שחרור מהיר למוט אוכף). ישנם 1140 הקומבינציות אסידו בין 20 תרופות, כל אחד עם פוטנציאל יש סינרגיה חזקה נגד שחרור מהיר למוט אוכף. שם כבר אין שיטה חסכונית כדי למדוד את תגובות בין תרופתיות בין תרופות רבות, הצלת חיים פוטנציאל סינרגטי שילובים נשארים שלא נבדקו.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוט למדוד pairwise וכיוונית תרופתיות באמצעות דגימת רק באלכסון של וזמינותו לוח שחמט (איור 4 , איור 5). הרעיון הבסיסי של דגימה האלכסון של ניסוי לוח שחמט היתה תיאוריה על-ידי Berenbaum בעבודתו החלוצי ב 19789. ובכל זאת, גישה זו רק לאחרונה הוחל סמים סינרגיה מסכי10,11,12. אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו עם Escherichia coli (e. coli) ותפקיד של צמיחה. עם זאת, נציין כי הפרוטוקול עצמאי של מינים ביולוגיים, פנוטיפ של עניין, ולכן ניתן להחיל את המידה של סמים גבוהים סינרגיה בהקשרים ביולוגיים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

שילוב סינרגטי סמים יש על יעילות גבוהה יותר בהשוואה להשפעות של סמים בודדים. מבחני לוח שחמט, איפה הסמים משולבים במינונים רבים מאפשרים מדידה רגיש של תגובות בין תרופתיות. עם זאת, מבחני האלה יקרות, אל תגדיל גם עבור מדידת אינטראקציה בין תרופות רבות. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה דיווחו על סמים אינטראקציה מדידות באמצעות דגימה אלכסוני של לוח שחמט מסורתי וזמינותו. מתודולוגיה חלופית זו במידה רבה מקטין את העלות של סמים אינטראקציה ניסויים ומאפשר אינטראקציה המדידה שילובים עם תרופות רבות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות pairwise שלושה, אחד אינטראקציה משולשת בין שלושה אנטיביוטיקה על כפולות, תוך חמישה ימים, תוך שימוש רק שלושה microplates 96-ובכן וציוד מעבדה סטנדרטיים. אנו מציגים תוצאות נציג מראה כי שילוב שלוש-אנטיביוטיקה Levofloxacin + חומצה Nalidixic + פניצילין G הוא סינרגטי. פרוטוקול שלנו להרחבה מדרגית כדי למדוד אינטראקציות בין תרופות רבות, בהקשרים אחרים ביולוגי, המאפשרות מסכי יעיל עבור סינרגיה סמים רב נגד פתוגנים וגידולים.

בעבר דיווחנו את האינטראקציות pairwise בין שלושה סוגי סמים: לב, NAL ו- PNG מבוסס על בדיקות מבחני ולמחקר לוח שחמט, שבו שתי התרופות היו בשילוב13,מטריצה 4 x 414. בעוד NAL ולא לב היו סינרגטי, PNG דווח להיות עוינת עם13,לב והן NAL14. כאן, אנחנו אומת אינטראקציות pairwise אלה נמדד אינטראקציה משולשת בין תרופות אלו שלושה שימוש assay אלכסוני של. התוצאות שלנו להפגין כי לב + NAL + PNG היא שילוב סינרגטי של אנטיביוטיקה 3-way. ייצוג סכמטי עבור התוצאות של סעיפים בודדים ניתוח ניסיוני ניתנו בצד ימין של איור 7 ו איור 8. כאן, אנו מציגים לפרש תוצאות raw נציג שלוש קריאות צלחת, הניתנות באיור9. הקריאה הפלטה מקביל דילול טורי וארוך ניסויים שנערכו שלבים 2 ו- 3. התחתון שני בצלחת הקריאות צלחות אינטראקציה כפולים שנערך בשלב 4.
הנתונים הגולמיים באיור 9 מראה כי הצמיחה העליונה היא סביב 0.55, אבל יש צפיפות אופטית 0.05 של התקשורת עצמה, כפי שנצפתה ה OD600 של ריכוז גבוה סמים שבה אין צמיחה. לכן, אנו מגדירים IC50 כמו (0.55-0.05)/2 = 0.25. עבור כל מנה-תגובה, הבארות ממוקם קרוב לערך זה מוצגים עם כתום.
החצי העליון של איור 9A מציגה את התוצאות של שלב 2, טורי מנה-תגובה ניסוי. בארות IC50 לב הוא עמודה 10 עובדים בשני משכפל, אשר תואמות את 4 ng/mL. IC50 עבור NAL ו- PNG נמצאים 3 µg/mL 25 µg/mL, בהתאמה. ריכוזים אלה תואמים ריכוז 1 x שמוצג באיור 7. החצי התחתון של איור 9B מציגה את התוצאות של שלב 3, ניסויים של מנה-תגובה לינארית. לב, NAL, IC50 של PNG נמצאים 0.4 x, 0.8 x ו- 1.2 x, בהתאמה. ריכוזים אלה מוקצות כמו ה 1 X IC50 שלב 4.
שתי צלחות המתאים שכפול שני ניסויים מוצגות באיור איור 9B, איפה IC50 בארות מוצגים עם כתום. בצלחת 1, כל התרופות יחיד יש IC50 שלהם 1 x ריכוז. IC50 הצפוי עבור שילוב pairwise או משולשת מחושב לפי הממוצע החשבוני של סמים המרכיבים אותה, שהופך IC50 הצפוי עבור כל שילובי גם 1 x ריכוז. בצלחת 2, לב ו- PNG יש IC50 שלהם-ריכוז 1 x, אך NAL IC50 ב 1.2 x. IC50 הצפוי עבור כל שילוב מוגדר באמצעות אמצעי האריתמטיקה של ערכים אלה IC50. לדוגמה, IC50 הצפוי עבור לב + NAL ו- NAL + PNG היא 1.1 x. האינטראקציה סמים ניקוד (FIC) עבור כל צירוף הוא מחושב על ידי חלוקת נצפתה IC50 עם IC50 הצפוי, כפי שמוצג על הצד הימני של הלוחות. בדיקה של עשרות FIC שתי צלחות מדגים לב + NAL ולא לב + NAL + PNG הם סינרגטי, ואילו לב + PNG ו- NAL + PNG הם אויבת. FIC ציוניהם ב שתי צלחות הם מסכימים, המשנה את המהימנות של הפרוטוקול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> איור 1: Null ההגדרה המודל עבור לואי additivity סמים אינטראקציה דגם- 5 x 5 שתי מטריצות על microplate, שבו סמים A באופן ליניארי גדל בציר אחד כפי שמוצג בחלק השמאלי, ריכוז העליון של התרופה מעכב הפנוטיפ לכימות (למעלה מימין). התוספת של מטריצות אלה מוצג באמצע, שבו הקווים המחברים equipotent סמים ריכוזים של כל תרופה יחידה יש ריכוז זהה כמו סמים א כאשר תאים נוספים על "בשביל" של שילובים תרופתיים ריכוז, צפוי כי פנוטיפ מוקלט על הקו הזה יהיה שווה בשביל הבארות שהיא מתחברת. בניסוי זה האינטראקציה האני-עצמי בסמים, isobole המתארים את הפנוטיפ (מוצג עם קו ירוק מקווקו) צפוי להיות ליניארי, הגדרת המודל additivity null. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> איור 2: תרופתיות Pairwise לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. כאשר שתי תרופות משולבות ב- assay לוח שחמט כמו באיור 1, קווי המתאר isophenotypic נצפתה עשוי להיות ישר, קמורה או קעורה. בצד ימין, קווי המתאר isophenotypic אפשרי (קווים ירוק מקווקו) הם יונחו על מבחני לוח שחמט. שילובים תרופתיים עם קווי מתאר isophenotypic ישר הן לאו-תוסף, קווי המתאר אינם שונים בכשל תרופתי האני-עצמי, אשר הוא לואי-תוסף לפי ההגדרה. כאשר קווי המתאר isophenotypic באופן משמעותי קעורים או קמורים, השילוב הוא סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> איור 3: 3 חלקים תרופתיות לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. בדומה וזמינותו לוח שחמט עבור אינטראקציות pairwise, שלוש-סמים משולבים ברשת תלת-ממד ("checkercube"), שבו כל תרופה הוא גדל באופן ליניארי בציר אחד. אם הסמים שלושה היו זהים, פני השטח isophenotypic צפוי להיות שטוח, מגדיר את additivity עבור שלושה שילובים תרופתיים. אם השטח יותר קעורים או קמורים יותר מודל null זה לאו-תוסף, שילובים תרופתיים הם סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> איור 4: שיטת באלכסון כדי למדוד תרופתיות pairwise. עבור כל לוח שחמט assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים מלבנים בצבע ארגמן. i ו- ii הם ליניארי סמים בכול ריכוזים. השלישי הוא מוערך על ידי תערובת 1:1 של שתי תרופות ו באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היא תרופה בודדת. FIC שווה IC50 נצפתה בשילוב מחולק את IC50 הצפויה של שתי תרופות יחיד. עבור המודל additivity לאו, IC50 הצפוי נאמדת באמצעות IC50 הממוצע של התרופות שני יחיד. ערך FIC 1 עבור זוגות לואי-תוסף והיא נמוכה או גבוהה מ- 1 עבור זוגות סינרגטי או עוינת, בהתאמה2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> איור 5: שיטת באלכסון כדי למדוד-כיוונית תרופתיות. עבור כל checkercube assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים. i, ii ו- iii נמצאים ליניארי סמים בכול ריכוזים. iv נמדד על ידי ביצוע של 1:1:1 תערובת של שלושת התרופות באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היה תרופה בודדת. הריכוז המעכב החלקי שווה ה IC שנצפה50 בשילוב מחולק את IC50 הצפוי מקבלים שלוש תרופות יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> איור 6: זרימת עבודה עבור הפרוטוקול בשיטה אלכסונית המתוארים בזאת ואת פרטי ההתקנה עבור כל microplate. הצלחת באיור 4 יום מתבצע תוך שכפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> איור 7: דילול טורי וארוך מנה-תגובה ניסויים. (א) הכנה של דילול טורי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר ה 16 IC50 טורי, שמוצג כתום, נבחרה עבור כל סם טעם למחרת של ליניארי דילול מנה-תגובה ניסויים. (B) הכנה של דילול ליניארי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר 16 שעות. לכל סם, IC50s שנבחר אשר ישמש בליום סמים אינטראקציה ניסויים מוצגים ב orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> איור 8: סמים אינטראקציה ניסויים. הכנת ניסויים האינטראקציה הוא דומה יחיד סמים ליניארי מינון-תגובות, למעט 1:1 או 1:1:1 תערובת של תרופות משמש לשניים או שלוש תרופות במינון-תגובות, בהתאמה. נצפתה IC50s עבור כל מנה-תגובה, מתואר ב orange, משמשים לחישוב FIC ציונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> איור 9: נציג ניסוי תוצאות. נציג התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים, עם פרטי ההתקשרות לטקסט הראשי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...