Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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यह काम NIGMS ग्रांट P50GM107618 द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखकों ने पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों और सुझावों के लिए सोहर बी Weinstein का शुक्रिया अदा किया ।

नोट: किसी भी छोटे अणु कि रोकता ई. कोलाई बैक्टीरिया विकास विकर्ण विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, levofloxacin (लेव), nalidixic एसिड (NAL), और पेनिसिलिन जी (PNG) एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, क्योंकि इन दवाओं एक प्रमुख तीन तरह का तालमेल दिखा । इस प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो आरेख 6के रूप में दिखाया गया है । कमरे के तापमान पर सभी कदम उठाने । बैक्टीरिया और दवाओं के ताजा aliquots प्रत्येक दिन का उपयोग करें । ई. कोलाईके लिए उपयुक्त सुरक्षा के स्तर के तहत प्रयोग करते हैं ।
1. तैयारी कदम
<ol><li>आसुत जल और मिश्रण के 1 एल के लिए £ शोरबा के 25 जी जोड़कर Luria-Bertani (पौंड) मीडिया तैयार करते हैं । 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर autoclaved मीडिया की दुकान ।</li>
	<li>बाँझ ५०% ग्लिसरॉल और बैक्टीरियल कोशिकाओं के बराबर मात्रा में मिश्रण से ई. कोलाई ग्लिसरॉल स्टॉक्स तैयार करें६०० = 1 पौंड शोरबा और फ्रीज में १५० µ l aliquots में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में-८० डिग्री सेल्सियस ।</li>
	<li>dimethyl sulfoxide (DMSO) प्रत्येक की 1 मिलीलीटर में एंटीबायोटिक्स, लेव, NAL और PNG के 20 मिलीग्राम भंग । पतला लेव हल 100x को ०.२ µ g/मब को मिलाकर 10 µ l म लेव हल के साथ ९९० µ l के DMSO. का प्रयोग करें ०.२ मिलीग्राम/एमएल लेव्, और 20 मिलीग्राम/एमएल NAL और PNG कार्यवाही चरणों में ।</li>
	<li>Aliquot ५० µ एल प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और फ्रीज पर-20 ° c ।</li>
	<li>लो-८० ° c से ई. कोलाई के १ १५० µ l aliquot. गल.</li>
	<li>एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में ई. कोलाई ग्लिसरॉल शेयर के १०० µ एल जोड़ें ।</li>
	<li>एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में ट्यूबों २०० rpm पर रात भर हिला ।</li>
</ol>2. धारावाहिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग
<ol><li>-20 डिग्री सेल्सियस से ड्रग्स लेव, NAL और PNG के एक aliquot ले लो, उंहें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गल छोड़ दो और इन दवाओं के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए तैयार ।</li>
	<li>पौंड मीडिया के ९९० µ एल और विलायक (DMSO) के ११० µ एल के मिश्रण से £ 10% सोल के ११०० µ एल तैयार करें ।</li>
	<li>के ५०० µ l को तैयार करके पौंड-10% लेव े को मिलाकर ४५० µ l का £ मीडिया और ५० µ l का लेव े ।</li>
	<li>भंवर पौंड-10% सोल के लिए सबसे अधिक सेटिंग में 5 एस । एक ९६-अच्छी तरह से microplate में कुओं के शीर्ष चार पंक्तियों के लिए पौंड-10% सोल के 20 µ एल जोड़ें ।</li>
	<li>भंवर पौंड-10% लेव के लिए उच्चतम सेटिंग में 5 एस । एक पंक्ति में पहली अच्छी तरह से £ 10% लेव के 20 µ एल जोड़ें</li>
	<li>पौंड के लिए दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने तैयार-10% लेव पहले अच्छी तरह से 20 µ एल लेने से, दूसरी अच्छी तरह से जोड़ने, ऊपर और नीचे पांच बार pipetting । यह सभी कुओं के लिए क्रमिक रूप से 11 वीं अच्छी तरह से दोहराएं, जो ४० µ एल (चित्रा 7A) के साथ समाप्त होता है ।</li>
	<li>एक micropipette का उपयोग करके 11 अच्छी तरह से सामग्री के 20 µ l को निकालें और छोड़ें ।</li>
	<li>दोहराएँ कदम 2.3-2.7 ड्रग्स NAL और microplate, क्रमशः की दूसरी और तीसरी पंक्तियों का उपयोग कर PNG के लिए.</li>
	<li>दोहराएं चरण 2.3-2.7 ड्रग लेव के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में फिर से चौथी पंक्ति पर ।</li>
	<li>एक spectrophotometer का प्रयोग, संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो६०० उपाय (1.5-1.7 कदम) ।</li>
	<li>पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पतला ०.०१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए । एक जलाशय में डालो ।</li>
	<li>एक मल्टीचैनल micropipette का प्रयोग, ८० µ एल जोड़ें दवा धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए पतला कोशिकाओं के चरण 2.4-2.9 में तैयार । एक अच्छी तरह से अंतिम दवा सांद्रता चित्रा 7Aमें दिखाया गया है । वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट सील ।</li>
	<li>३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली मशीन ।</li>
	<li>चरण 3 में उपयोग करने के लिए एक नया बैक्टीरियल कल्चर प्रारंभ करें (दोहराएं चरण 1.5-1.7) ।</li>
</ol>3. रैखिक कमजोर पड़ने खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग
<ol><li>सीरियल कमजोर पड़ने खुराक के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषित-चरण 2 से प्रतिक्रिया प्लेट एक प्लेट रीडर (चित्रा 7A सही) का उपयोग और निम्न चरणों के आधार पर परिणामों की व्याख्या.</li>
	<li>प्रत्येक पंक्ति के लिए कोई दवा नियंत्रण में वृद्धि के साथ एक अच्छी तरह से वृद्धि को विभाजित करके विकास को सामान्य और कोई दवा की हालत के लिए६००ओडी सामान्य करके प्रतिशत वृद्धि की गणना.</li>
	<li>प्रत्येक दवा के लिए, कि कुओं का पता लगाने ~ ५०% विकास निषेध (IC50), चित्र 7A सहीमें नारंगी में दिखाया गया है । प्रत्येक दवा के लिए "धारावाहिक IC50" के रूप में इन कुओं में एकाग्रता निरुपित ।</li>
	<li>गल ताजी दवा aliquots, पौंड मीडिया और विलायक (DMSO) एक 9:1 अनुपात में और पौंड मीडिया और दवा एक 9:1 अनुपात में, जहां दवा की एकाग्रता है 100x एक दवा के धारावाहिक IC50 का मिश्रण करके पौंड मीडिया को जोड़ने के द्वारा lb-10% सोल की 1 मिलीलीटर तैयार , के रूप में ३.३ कदम पर चुना है ।</li>
	<li>रैखिक मात्रा में ड्रग्स लेव, NAL और PNG 11 सांद्रता में, पौंड-10% दवा और पौंड-10% सोल में चित्रा 7Bमें दिखाया गया वॉल्यूम में मिश्रण से तैयार करें ।</li>
	<li>चौथी पंक्ति पर एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लेव की रैखिकता बढ़ती खुराक तैयार करते हैं ।</li>
	<li>मापने६०० संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो २.१४ चरण में शुरू कर दिया ।</li>
	<li>पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पतला ०.०१ के एक आयुध डिपो६०० के लिए । एक जलाशय में डालो ।</li>
	<li>एक मल्टीचैनल micropipette का उपयोग ३.६ चरण में तैयार दवा रैखिक कमजोर पड़ने के लिए पर पतला कोशिकाओं के ८० µ एल जोड़ें. एक अच्छी तरह से अंतिम दवा सांद्रता चित्रा 7Bमें दिखाया गया है । नोट: मध्य अच्छी तरह से खुराक में-प्रतिक्रिया इस दवा के लिए धारावाहिक IC50 प्राप्त होगा. सील प्लेट वाष्पीकरण को रोकने के लिए ।</li>
	<li>३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए थाली मशीन ।</li>
	<li>शुरू दो ताजा बैक्टीरियल संस्कृतियों चरण 4 में उपयोग करने के लिए (दोहराएं कदम 1.5-1.7) ।</li>
</ol>4. कर्ण ड्रग इंटरेक्शन प्रयोग
<ol><li>चरण 3 (चित्रा 7B) से प्रतिक्रिया-रैखिक कमजोर पड़ने खुराक के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषक को मापने ।</li>
	<li>प्रत्येक दवा के लिए, IC50 में हुई एकाग्रता का चयन करें और 100x IC50 सांद्रता में ड्रग लेव, NAL और PNG तैयार करें ।</li>
	<li>गल ताजी दवाइयां, प्रत्येक दवा के लिए 100x IC50 तैयार करें और लेव + NAL, लेव + png और NAL + png और 1:1:1 औषध मिश्रण की मात्रा द्वारा 1:1 औषध मिश्रण तैयार कर लेव + NAL + png ।</li>
	<li>चित्र 8में दिखाए गए अनुसार दवा इंटरैक्शन प्रयोगों के लिए दो प्लेट तैयार करें.</li>
	<li>मापने६०० संस्कृतियों के 1:10 कमजोर पड़ने के आयुध डिपो ३.११ चरण में शुरू कर दिया ।</li>
	<li>तैयार आयुध डिपो६०० = ०.०१ पौंड मीडिया के २ १० मिलीलीटर में दो संस्कृतियों के कमजोर पड़ने ।</li>
	<li>1 और 2, क्रमशः प्लेटों पर संस्कृति 1 और 2 से कोशिकाओं के ८० µ एल जोड़ें । प्लेटों को सील वाष्पीकरण को रोकने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए प्लेटें मशीन ।</li>
</ol>5. कर्ण ड्रग इंटरेक्शन स्कोर
<ol><li>विकर्ण दवा बातचीत प्रयोग प्लेटों के लिए आयुध डिपो६०० अवशोषक चरण 4 से उपाय ।</li>
	<li>प्रत्येक पंक्ति के लिए अच्छी तरह से कोई दवा नियंत्रण में वृद्धि के साथ एक अच्छी तरह से वृद्धि में विभाजित करके विकास को सामान्य.</li>
	<li>प्रत्येक पंक्ति के लिए, स्तंभ है कि विकास के निकटतम IC50, चित्र 8 सही में नारंगी में दिखाया गया है पता लगाएँ । इस कुआं में दवा के सापेक्ष एकाग्रता के आधार पर IC50 निरुपित ।</li>
	<li>के लिए लेव + NAL, लेव + png और NAL + png और लेव + NAL + png खुराक-प्रतिक्रियाएं, प्रत्येक संयोजन में एकल दवाओं के IC50 औसत द्वारा अपेक्षित IC50 की गणना । ध्यान दें कि औसत सटीक अपेक्षित IC50 गणना के लिए एक सरल सन्निकटन के रूप में12से पहले वर्णित है ।</li>
	<li>प्रत्येक संयोजन में अपेक्षित IC50 द्वारा मनाया IC50 विभाजित करके आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता (FIC) स्कोर की गणना.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

रोगज़नक़ों या ट्यूमर के खिलाफ दवा संयोजनों का उपयोग एक आकर्षक संभावना है, विशेष रूप से सुखाने एंटीबायोटिक पाइप लाइन की परिस्थितियों में । हालांकि, इस क्षमता को कम दो कठिनाइयों से प्रभावित है । पहली कठिनाई संभव संयोजनों की खगोलीय संख्या है । वहां रहे हैं, उदाहरण के लिए, १०० एंटीबायोटिक दवाओं के बीच ४९५० संभव pairwise संयोजन । १०० एंटीबायोटिक (2१००) के बीच सभी संभव संयोजन पृथ्वी पर बैक्टीरिया की संख्या के साथ परिमाण के एक ही आदेश पर है (~ 1030) । कैसे इन संभावनाओं के बीच दृढ़ता से synergistic संयोजन की भविष्यवाणी करने के लिए कई गणना अध्ययन का विषय रहा है । दूसरी कठिनाई उच्च आदेश दवा बातचीत का माप है । विचार है कि एक गणना मंच का सुझाव है कि एक निश्चित 10 दवा संयोजन दृढ़ता से एक निश्चित रोगज़नक़ के खिलाफ synergistic है हो सकता है । दवा बातचीत का परीक्षण करने के लिए परंपरागत तरीकों को सत्यापित करना या इस परिकल्पना का खंडन करना भी महँगा पड़ता है, इसलिए कई दवाओं के बीच तालमेल का अध्ययन वैज्ञानिक जाँच की सीमाओं से बाहर रहा है. विकर्ण विधि है, जो पहले लगभग 30 साल पहले का प्रस्ताव किया गया था और कुछ हाल ही में तालमेल स्क्रीन में इस्तेमाल पहली समस्या के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करते हैं, कई जोड़े के बीच बातचीत के परीक्षण की अनुमति देकर । यह पारंपरिक परख के एक जानकारीपूर्ण नमूना द्वारा दूसरी समस्या हल करती है और उच्च आदेश दवा बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है ।
हम महत्वपूर्ण बात ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल दवा बातचीत माप के लिए एक रैखिक खुराक का उपयोग करता है, भी कमजोर बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए. रैखिक खुराक के लिए सही एकाग्रता रेंज की स्थापना एक चुनौतीपूर्ण काम है । पहले एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करके, हम रैखिक खुराक के लिए खोज अंतरिक्ष के बारे में एक सूचित निर्णय करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता 2-गुना या उच्चतर सीरियल कमजोर पड़ने दवा बातचीत परीक्षण के लिए. इस तरह के एक संशोधन प्रयोग समय को कम करने और अधिक बातचीत के परीक्षण की अनुमति होगी; हालांकि, यह केवल दृढ़ता से synergistic या विरोधी बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता होगी ।
प्रोटोकॉल हम वर्णित pairwise या तीन तरह की बातचीत का माप दिखाता है । प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि एकल एजेंट संयोजन के रूप में एक ही थाली पर हैं, थाली विविधताओं के कारण पूर्वाग्रह को कम करने के लिए । इसलिए, प्रोटोकॉल को बातचीत के उपाय करने के लिए समायोजित किया जा सकता 7-तुच्छ संशोधनों द्वारा तरह संयोजनों । 7 से अधिक दवाओं के संयोजन की आवश्यकता होगी अधिक से अधिक १ ९६-अच्छी तरह से microplate और अतिरिक्त विचार सही डेटा एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, जैसे इंटर प्लेट प्रतिकृति.
विकर्ण विधि की एक उल्लेखनीय सीमा प्रतिबंध है कि परख में प्रत्येक दवा ब्याज की phenotype को बाधित करना चाहिए है । इसलिए, विकर्ण विधि सक्रिय एजेंटों और निष्क्रिय adjuvants के बीच बातचीत को समझने के लिए उपयोगी नहीं है । इस तरह के ' potentiating ' बातचीत आनंद या उच्चतम एकल एजेंट मॉडल के रूप में वैकल्पिक मॉडल के तहत अध्ययन किया जा सकता है ।
उच्च आदेश दवा बातचीत के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार के लिए नल मॉडल पसंद है "अपेक्षित IC50." जब दो दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन के प्रभाव केवल एक दवा प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । जब तीन दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन प्रभाव एकल प्रभाव या pairwise प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि तीन औषधियों के सभी pairwise युग्म synergistic हैं, तो आशा की जा सकती है कि इन औषधियों में तीन तरह का तालमेल दिखाई देगा. क्या pairwise बातचीत से उंमीद है कि तीन तरह से है बातचीत विचलन हाल ही में डब किया गया है "आपात बातचीत"16,17। सादगी के लिए, हमारे प्रोटोकॉल तीन तरह संयोजन की "नेट बातचीत," जो एकल दवा प्रभाव के रूप में नल मॉडल को परिभाषित करता है की माप का वर्णन । हालांकि, डेटा प्रोटोकॉल से प्राप्त की है कि तीन तरह के संयोजन के आकस्मिक बातचीत की गणना करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे विश्लेषण में, हम तीन तरह के संयोजन की उंमीद IC50 एकल दवा IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया । वैकल्पिक रूप से, अपेक्षित IC50 pairwise संयोजनों (~ 1.1-1.2) के IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया जा सकता है । जब मनाया IC50 इस विकल्प की उंमीद IC50 द्वारा विभाजित है, प्राप्त FIC तीन तरह के संयोजन के लिए आपात FIC प्रदान करता है, के रूप में पहले12वर्णित है । इस विचार से पता चलता है कि लेव + NAL + png क्या तीन दवाओं के बीच pairwise बातचीत से उंमीद की जाएगी से अधिक synergistic है, का प्रदर्शन है कि लेव + NAL + png आपात तालमेल है ।

दवा संयोजन एक घटक दवाओं के प्रभाव दिया phenotype पर आश्चर्यजनक रूप से उच्च या कम प्रभाव प्रदर्शन कर सकते हैं, synergistic या विरोधी दवा बातचीत करने के लिए इसी, क्रमशः1,2,3. synergistic संयोजनों के उपयोग की अनुमति दे सकता है प्रभावकारिता वृद्धि और खुराक के लिए वृद्धि-पक्ष-प्रभाव राहत के लिए कमी. संयोजन उपचार भी सेलुलर मशीनरी के लिए कई असफलताओं लागू कर सकते हैं, जिससे प्रतिरोध4के लिए संभावित विकासवादी भागने तंत्र को अवरुद्ध । इसलिए, तीन या अधिक दवाओं के संयोजन नियमित रूप से रोगज़नक़ या कैंसर के उपचार में प्रयोग किया जाता है5।
सिनर्जी और विरोध एक अपेक्षित व्यक्तिगत दवा प्रभाव को देखते हुए प्रभाव बनाम एक संयोजन के प्रभाव के बीच तुलना द्वारा परिभाषित कर रहे हैं । दवा बातचीत के लिए मॉडलों के अलावा, Loewe additivity सबसे कड़े है और एक अच्छी तरह से परिभाषित नल मॉडल (चित्रा 1)6है, और आस्थगित सिनर्जी/विरोध बातचीत दवा इस्तेमाल किया एकाग्रता के स्वतंत्र है 6 , 7. हालांकि, Loewe मॉडल एक pairwise बातचीत परीक्षण के लिए भी प्रयोग महंगा है । दवा बातचीत परख परंपरागत रूप से दवा एकाग्रता संयोजन (एक चेकरबोर्ड परख) (चित्रा 2)के एक 2d मैट्रिक्स के शामिल हैं । अगर 5 खुराकों प्रत्येक दवा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, तो 25 संयोजनों की आवश्यकता है, एक microplate के एक आधे के लिए इसी अगर प्रयोग दोहराने में आयोजित की जाती हैं । इस दृष्टिकोण की लागत बहु दवा संयोजन (चित्रा 3)के लिए Loewe additivity मॉडल द्वारा सिनर्जी माप पर प्रतिबंध लगाता है । उदाहरण के लिए, एक 10 तरह की बातचीत का परीक्षण करने के लिए, पारंपरिक तरीकों से अधिक १००,००० microplates की आवश्यकता होगी, कड़े, अच्छी तरह से theorized और एकाग्रता-स्वतंत्र Loewe additivity मॉडल द्वारा उच्च क्रम के तालमेल के प्रायोगिक माप को छोडक़र 8.
वर्तमान नैदानिक उपचार केवल संभव दवा संयोजन का एक अंश का उपयोग । उदाहरण के लिए, सक्रिय तपेदिक के मानक उपचार तीन एंटीबायोटिक दवाओं का एक संयोजन है । वहाँ लगभग 20 माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) उपचार में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं रहे हैं । वहां ११४० संभव 3 तरह संयोजन 20 दवाओं, एमटीबीके खिलाफ एक मजबूत तालमेल की क्षमता के साथ प्रत्येक के बीच कर रहे हैं । के रूप में वहां कोई कीमत प्रभावी विधि कई दवाओं के बीच दवा बातचीत को मापने के लिए किया गया है, संभावित जीवन रक्षक synergistic संयोजन untested रहते हैं ।
यहां, हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए pairwise और तीन तरह के एक चेकरबोर्ड परख (चित्रा 4 और चित्रा 5)के केवल विकर्ण नमूना द्वारा दवा बातचीत उपाय । एक चेकरबोर्ड प्रयोग के विकर्ण नमूना की अंतर्निहित अवधारणा १९७८9में अपने प्राथमिक काम में Berenbaum द्वारा theorized था । फिर भी, यह दृष्टिकोण ही हाल ही में दवा सिनर्जी स्क्रीन10,11,12पर लागू किया गया है । हम ई कोलाई (ई. कोलाई) और विकास phenotype के साथ हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित । तथापि, हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल जैविक प्रजातियों और ब्याज की phenotype से स्वतंत्र है, और इसलिए अंय जैविक संदर्भों में उच्च आदेश दवा तालमेल की माप के लिए लागू किया जा सकता है ।

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

एक synergistic दवा संयोजन व्यक्तिगत दवाओं के प्रभाव की तुलना में एक उच्च प्रभावकारिता है । चेकरबोर्ड परख, जहां दवाओं कई खुराकों में संयुक्त कर रहे हैं, दवा बातचीत के संवेदनशील माप की अनुमति दें । हालांकि, इन परख महंगा है और कई दवाओं के बीच बातचीत को मापने के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । कई हाल के अध्ययनों की रिपोर्ट है दवा संपर्क माप पारंपरिक चेकरबोर्ड परख के एक तिरछे नमूने का उपयोग कर । इस वैकल्पिक पद्धति बहुत दवा बातचीत प्रयोगों की लागत कम हो जाती है और कई दवाओं के साथ संयोजन के लिए बातचीत माप की अनुमति देता है. यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए तीन pairwise बातचीत और डुप्लिकेट में तीन एंटीबायोटिक दवाओं के बीच १ ३ तरह की बातचीत को मापने, पांच दिनों में, केवल ३ ९६-well microplates और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर । हम मौजूद प्रतिनिधि परिणाम दिखा रहा है कि Levofloxacin के तीन एंटीबायोटिक संयोजन + Nalidixic एसिड + पेनिसिलिन जी synergistic है । हमारे प्रोटोकॉल को तराजू कई दवाओं के बीच बातचीत और अंय जैविक संदर्भों में उपाय, बहु के लिए कुशल स्क्रीन रोगजनकों और ट्यूमर के खिलाफ दवा सहयोग के लिए अनुमति देता है ।

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

विकर्ण विधि दवाओं के किसी भी संख्या के बीच तालमेल को मापने के लिए

इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे pairwise और तीन तरह के दवा संयोजनों के लिए Loewe additivity आधारित दवा बातचीत माप बनाने के लिए का वर्णन ।

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

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