Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIGMS Grant P50GM107618. Forfatterne takker Zohar B. Weinstein for innsiktsfulle kommentarer og forslag på manuskriptet.

Merk: Noen små molekyl som hemmer E. coli bakterievekst kan brukes for metoden diagonal. I denne protokollen, levofloxacin (LEV), brukes nalidixic acid (endelig) og Penicillin G (PNG) som et eksempel, siden disse stoffene Vis en fremtredende treveis synergi. Arbeidsflyten denne protokollen vises som figur 6. Utføre alle skritt ved romtemperatur. Bruke friske dele bakterier og narkotika hver dag. Utføre eksperimentet under biosikkerhet nivåer passer til E. coli.
1. forberedelse
<ol><li>Forberede Luria-Bertani (LB) media ved å legge til 25 g av LB kjøttkraft 1 L destillert vann og bland. Autoclave ved 121 ° C i 15 min og store autoklaveres media ved romtemperatur.</li>
	<li>Forberede E. coli glyserol aksjer ved å blande like volum av sterile 50% glyserol og bakterieceller utvannet OD600 = 1 i LB buljong og fryse 150 µL dele i 1,5 mL microcentrifuge rør på-80 ° C.</li>
	<li>Oppløse 20 mg av antibiotika, LEV, endelig og PNG i 1 mL av dimethyl sulfoxide (DMSO) hver. Fortynne LEV løsning 100 x 0,2 µg/mL ved å blande 10 µL av LEV løsning med 990 µL av DMSO. Bruk 0,2 mg/mL LEV og 20 mg/mL Beholderforgreningen og PNG i fortsetter trinnene.</li>
	<li>Aliquot 50 µL av hver antibiotika 1,5 mL microcentrifuge rør og Frys på 20 ° C.</li>
	<li>Ta en 150 µL aliquot av E. coli -80 ° c. Tine.</li>
	<li>Legge til 100 µL av E. coli glyserol lager i 5 mL LB medium i en 14 mL kultur rør.</li>
	<li>Riste rør i en 37 ° C inkubator overnatting på 200 rpm.</li>
</ol>2. føljetong fortynning Dose-respons eksperiment
<ol><li>Ta en aliquot av narkotika LEV, endelig og PNG fra 20 ° C, la dem ved romtemperatur for 10 min å tine og forberede for seriell fortynninger av disse stoffene.</li>
	<li>Forbered 1100 µL av LB - 10% sol ved å blande 990 µL av LB media og 110 µL løsemiddel (DMSO).</li>
	<li>Forbered 500 µL av LB - 10% LEV ved å blande 450 µL av LB media og 50 µL av LEV.</li>
	<li>Vortex LB - 10% sol 5 s på den høyeste innstillingen. Legge til 20 µL av LB - 10% sol på de fire radene i brønner i en 96-brønnen microplate.</li>
	<li>Vortex LB - 10% LEV 5 s på den høyeste innstillingen. Legge til 20 µL av LB - 10% LEV den første brønnen i raden A.</li>
	<li>Forberede todelt føljetong fortynning LB - 10% LEV ved å ta 20 µL fra den første brønnen, legge til andre brønnen pipettering opp og ned fem ganger. Gjenta dette for alle brønnene sekvensielt til 11th godt, som ender opp med 40 µL (figur 7A).</li>
	<li>Fjerne og slette 20 µL av innholdet fra 11th også, ved hjelp av brønnene.</li>
	<li>Gjenta 2.3-2.7 for narkotika Beholderforgreningen og PNG med andre og tredje radene i microplate, henholdsvis.</li>
	<li>Gjenta trinn 2.3-2.7 for stoffet LEV igjen på fjerde rad som en positiv internkontroll.</li>
	<li>Bruker et spektrofotometer, måle OD600 på en 1:10 fortynning av kultur (trinn 1.5-1.7).</li>
	<li>Fortynne cellene i 5 mL LB medier til et OD600 av 0,01. Hell i et reservoar.</li>
	<li>Bruker flerkanals brønnene, legge til 80 µL utvannet cellene narkotika føljetong fortynninger i trinn 2.4-2.9. De endelige narkotika konsentrasjonene i hver brønn er vist i figur 7A. Forsegle platen for å hindre fordampning.</li>
	<li>Inkuber platen i 16 h på 37 ° C.</li>
	<li>Starte en ny bakteriell kultur bruke i trinn 3 (Gjenta trinnene 1.5-1.7).</li>
</ol>3. lineær fortynning Dose-respons eksperiment
<ol><li>Måle OD600 absorbansen for seriell fortynning dose-respons plate fra trinn 2 bruker en plate reader (figur 7A til høyre), og tolk resultatene basert på følgende.</li>
	<li>Normalisere veksten ved å dele veksten i hver brønn med veksten i ingen stoffet kontrollen for hver rad og beregne prosent vekst ved å normalisere OD600til ingen betingelse for narkotika.</li>
	<li>Finn brønnene som har ~ 50% vekst hemming (IC50), vises i oransje i figur 7A høyrefor hvert legemiddel. Tilordne konsentrasjonen i disse brønnene som "føljetong IC50" av hvert legemiddel.</li>
	<li>Tine frisk narkotika dele, forberede 1 mL av LB - 10% sol ved å blande LB media og løsemidler (DMSO) 9:1-forhold og LB - 10% narkotika ved å blande LB media og stoffet i en 9:1 ratio, der stoffets konsentrasjon er 100 x av hvert legemiddel føljetong IC50 ør LB media , som valgt på trinn 3.3.</li>
	<li>Forberede lineært økende doser av legemidler LEV, endelig og PNG i 11 konsentrasjoner, ved å blande LB - 10% narkotika og LB - 10% sol i volumer som vist i figur 7B.</li>
	<li>Forberede lineært økende doser av LEV på fjerde rad som en positiv internkontroll.</li>
	<li>Måle OD600 av 1:10 fortynning av kulturen startet i trinn 2.14.</li>
	<li>Fortynne cellene i 5 mL LB medier til et OD600 av 0,01. Hell i et reservoar.</li>
	<li>Legge til 80 µL utvannet cellene på narkotika lineær fortynninger i trinn 3.6 med flerkanals brønnene. De endelige narkotika konsentrasjonene i hver brønn er vist i figur 7B. Merk: Midt i den dose-responsen får den serielle IC50 for dette stoffet. Forsegle plate å hindre fordampning.</li>
	<li>Inkuber platen i 16 h på 37 ° C.</li>
	<li>Starte to friske bakteriekulturer bruke i trinn 4 (Gjenta trinnene 1.5-1.7).</li>
</ol>4. diagonal narkotika samhandling eksperiment
<ol><li>Måle OD600 absorbansen for lineær fortynning dose-respons fra trinn 3 (figur 7B).</li>
	<li>For hvert legemiddel velge konsentrasjonen som resulterte i IC50 og forberede narkotika LEV, endelig og PNG i 100 x IC50 konsentrasjoner.</li>
	<li>Tine frisk narkotika, forberede 100 x IC50 for hver narkotika og forberede 1:1 narkotika blandinger av volumet av LEV + Beholderforgreningen, LEV + PNG og endelig + PNG og 1:1:1 narkotika blanding av volumet av LEV + Beholderforgreningen + PNG.</li>
	<li>Forberede to plater stoffet samhandling eksperimenter som vist i Figur 8.</li>
	<li>Måle OD600 av 1:10 fortynning av kulturer startet i trinn 3.11.</li>
	<li>Forberede OD600 = 0,01 fortynninger av to kulturer i to 10 mL LB medier.</li>
	<li>Legge til 80 µL av cellene fra kultur 1 og 2 på plater 1 og 2, henholdsvis. Forsegle platene for å hindre fordampning. Inkuber platene 16 h på 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonal narkotika samhandling score
<ol><li>Mål OD600 absorbansen for diagonal legemiddelinteraksjoner eksperimenter plater fra trinn 4.</li>
	<li>Normalisere veksten ved å dele veksten i hver brønn med veksten i ingen stoffet kontrollen for hver rad.</li>
	<li>Finn kolonnen som har vekst hemming nærmest til IC50, vises i oransje i Figur 8 til høyre for hver rad. Tilordne IC50 basert på den relative konsentrasjonen av stoffet i denne brønnen.</li>
	<li>For LEV + Beholderforgreningen, LEV + PNG og endelig + PNG og LEV + Beholderforgreningen + PNG dose-svar, beregne forventede IC50 ved å beregne IC50 av enkelt narkotika i hver kombinasjon. Merk at snitt er en enkel tilnærming til nøyaktig forventet IC50 beregning som beskrevet før12.</li>
	<li>Beregne Fractional inhibitoriske konsentrasjon (FIC) score ved å dele den observerte IC50 med den forventede IC50 i hver kombinasjon.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Bruk av rusmiddelkombinasjoner mot patogener eller svulster er et attraktivt prospekt, spesielt under omstendigheter tørking antibiotika rørledningen. Men er dette potensialet hindret av minst to problemer. Den første vanskeligheten er astronomiske antall mulige kombinasjoner. Det er for eksempel 4950 parvis kombinasjonene av 100 antibiotika. Alle mulige kombinasjoner av 100 antibiotika (2100) er i samme størrelsesorden med antall bakterier på jorden (~ 1030). Hvordan tippe sterkt synergistisk lettilgjengelige disse mulighetene har vært gjenstand for mange beregningsorientert studier. Den andre vanskeligheten er måling av signifikante interaksjoner. Vurdere at en beregningsorientert plattform kan foreslå at en bestemt 10-stoff kombinasjon er sterkt synergistisk mot en bestemt patogen. Tradisjonelle metoder for å teste interaksjoner er for kostbart å bekrefte eller tilbakevise denne hypotesen, derfor studiet av synergi blant mange legemidler er utenfor grensene av vitenskapelige undersøkelser. Diagonale metoden, som først ble foreslått nesten 30 år siden og ble brukt i noen nyere synergi skjermer gir et sterkt grunnlag for det første problemet, ved at testing av samspillet mellom mange parene. Det løser det andre problemet ved en opplysende utvalg av tradisjonelle analyser og lar studiet av signifikante interaksjoner.
Vi Merk viktigere at våre protokollen bruker en lineær dosering for narkotika samhandling mål, for å gi følsomheten for å oppdage selv svake interaksjoner. Etablere høyre konsentrasjon området for lineær dosering er en utfordrende oppgave. Ved første utfører en seriell fortynning, gjør vi en avgjørelse om søk plass for lineær dosering. Men protokollen kan endres for å bruke 2-fold eller høyere føljetong fortynninger for narkotika samhandling testing. Slik modifikasjon ville forkorte eksperiment tiden og la testing av flere interaksjoner; det ville imidlertid ha følsomheten å oppdage bare sterkt synergistisk eller antagonistiske interaksjoner.
Protokollen vi beskrev viser måling av parvis eller treveis interaksjoner. En viktig del av protokollen er at enkelt agenter er på samme plate som kombinasjon, minimere skjevhet på grunn av platen variasjoner. Derfor kan protokollen justeres for å måle interaksjoner opp til 7-veis kombinasjoner av trivielle modifikasjoner. Kombinasjoner av flere enn 7 narkotika vil kreve flere 96-brønnen microplate og ekstra hensyn må tas å sikre riktige dataintegrasjon, som Inter plate gjentak.
En kjent begrensning av metoden diagonal er begrensning at hvert legemiddel i analysen må hemme fenotypen av interesse. Derfor er diagonale metoden ikke nyttig for å forstå samspillet mellom aktive agenter og inert adjuvans. Slike 'potentiating' samhandlinger kan studeres under alternative modeller som lykke eller høyeste enkelt Agent.
En viktig faktor for analyse av signifikante interaksjoner er null modell valget for "forventet IC50." To stoffene er kombinert, kan kombinasjons effekt bare sammenlignes enkelt medikament-effekter. Tre medikamenter er kombinert, kan kombinasjons effekten sammenlignes til enkelteffekter eller parvis effekter. For eksempel hvis alle parvis kombinasjoner av tre narkotika synergistisk, kan så det forventes at disse stoffene vises en treveis synergi. En tre-veis samhandling er avvik fra forventet fra parvis samspill er blitt nylig kalt "emergent samspill"16,17. For enkelhet beskriver våre protokollen måling av treveis kombinasjons "netto samhandling," som definerer null modellen som enkelt narkotika effekter. Imidlertid kan dataene som hentes fra protokollen også brukes til å beregne emergent samspillet treveis kombinasjonen. I vår analyse definert vi den forventede IC50 treveis kombinasjonen som gjennomsnittet av enkelt stoffet IC50s. Den forventede IC50 kan også defineres som et gjennomsnitt av IC50s parvis kombinasjoner (~1.1-1.2). Når den observerte IC50 deles på denne alternative forventet IC50, gir de innhentet FIC emergent FIC for treveis kombinasjonen, som beskrevet tidligere12. Denne vurderingen avslører at LEV + Beholderforgreningen + PNG er mer synergistiske enn hva som ville forventes fra parvis samspillet mellom tre narkotika, viser at LEV + Beholderforgreningen + PNG har emergent synergi.

Rusmiddelkombinasjoner kan ha overraskende høy eller lav effekt på en fenotypen gitt effekten av konstituerende narkotika, tilsvarer synergistisk eller antagonistiske legemiddelinteraksjoner, henholdsvis1,2,3. Bruk av synergistisk kombinasjoner kan doseopptrapping effekt økning og dosereduksjon for bivirkning lettelse. Kombinasjon behandlinger kan også gjelde flere tilbakeslag for mobilnettet maskineri, og dermed blokkerer potensielle evolusjonære escape mekanismer til motstand4. Derfor brukes kombinasjoner av tre eller flere rusmidler rutinemessig i patogen eller kreft behandling5.
Synergi og antagonisme defineres av en sammenligning mellom observerte effekten av en kombinasjon versus en forventet virkning personlige narkotika effekter. Blant modellene for interaksjoner, Loewe additivity er den strengeste og har en godt definert null modell ()figur 1)6og tiltenkt synergi/antagonisme samspillet er uavhengig av narkotika konsentrasjonen brukes 6 , 7. men Loewe modellen er eksperimentelt kostbar aften for en parvis samhandling test. Stoffet samhandling analyser tradisjonelt består av en 2D matrise av konsentrasjon rusmiddelkombinasjoner (en dambrett analysen) ()figur 2). Hvis 5 doser brukes for hvert legemiddel, så 25 er nødvendig, svarer til en halvdel av en microplate hvis eksperimenter er gjennomført i replikere. Kostnadene ved denne tilnærmingen forbyr synergi måling av Loewe additivity modell for flere rusmiddelkombinasjoner ()Figur 3). For eksempel for å teste en 10-veis interaksjon, krever tradisjonelle metoder mer enn 100 tusen microplates, sperring eksperimentelle måling av høye synergier av strenge, godt theorized og konsentrasjon-uavhengig Loewe additivity modellen 8.
Gjeldende kliniske behandlinger bruker bare en brøkdel av mulig rusmiddelkombinasjoner. For eksempel er standard behandling av aktive tuberkulose en kombinasjon av tre antibiotika. Det er ca 20 antibiotika som brukes i Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Det er 1140 3-veis kombinasjonene blant 20 narkotika, hver med potensial til å ha en sterk synergi mot Mtb. Som det er ingen kostnadseffektiv metode for å måle interaksjoner blant mange legemidler, forblir potensielt livreddende synergistisk kombinasjoner uprøvd.
Her beskriver vi en enkel protokoll for å måle parvis og treveis interaksjoner ved prøvetaking bare diagonalen på et sjakkbrett analysen ((Figur 4 ) og figur 5). Underliggende begrepet prøvetaking diagonalen på et sjakkbrett eksperiment ble theorized av Berenbaum i hans banebrytende arbeid i 19789. Denne tilnærmingen er ennå, nylig brukt narkotika synergi skjermer10,11,12. Vi presenterer våre Protokoll med Escherichia coli (E. coli) og vekst fenotypen. Men oppmerksom vi på at protokollen er uavhengig av biologiske arter og fenotypen av interesse, og dermed kan brukes på måling av høye narkotika synergi i andre biologiske sammenhenger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

En synergistisk narkotika kombinasjon har en høyere effekt sammenlignet effekten av enkelte stoffer. Sjakkbrett analyser, der narkotika kombineres i mange doser, kan følsom måling av interaksjoner. Men disse analyser er kostbare og skalerer ikke godt for å måle samspillet mellom mange legemidler. Flere studier har rapportert narkotika samhandling mål med en diagonal utvalg av tradisjonelle sjakkbrett analysen. Denne alternative metoden sterkt reduserer kostnadene for stoffet samhandling eksperimenter og lar samhandling måling for kombinasjoner med mange legemidler. Her beskriver vi en protokoll for å måle de tre parvis interaksjonene og en tre-veis samspillet mellom tre antibiotika i duplikat, på fem dager, med bare tre 96-brønnen microplates og standard laboratorieutstyr. Vi presenterer representant resultater viser at tre-antibiotikaresistens kombinasjonen av Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G er synergistisk. Våre protokollen skalerer for å måle interaksjoner blant mange legemidler og i andre biologiske sammenhenger, muliggjør effektiv skjermene multi-Drug synergier mot patogener og svulster.

Tidligere vi har rapportert parvis samspillet mellom tre stoffer: LEV, endelig og PNG basert på testing i miniatyriserte sjakkbrett analyser, der to stoffene ble kombinert i en 4 x 4 matrix13,14. Mens Beholderforgreningen og LEV var synergistisk, ble PNG rapportert å være antagonistisk med både LEV og endelig13,14. Her vi bekreftet disse parvis interaksjoner og treveis samspillet mellom disse tre stoffene med en diagonal analysen. Våre resultater viser at LEV + Beholderforgreningen + PNG er en synergistisk 3-veis antibiotika kombinasjon. -Skjematiske representasjoner resultatene av delene personlige eksperimentelle prosedyren ble gitt på høyre side av figur 7 og Figur 8. Her presenterer vi og tolke representant rå resultater fra tre plate opplesninger, som gis i figur 9. Den øverste plate lese tilsvarer føljetong og lineære fortynning eksperimenter utført i trinn 2 og 3. Nederst to plate målingene er like samhandling plater utført i trinn 4.
Rådata i figur 9 viser at øverste vekst rundt 0,55, men det er en 0,05 optisk tetthet av selve mediet, som observert i OD600 for de høy narkotika der det er ingen vekst. Derfor vi definerer IC50 som (0.55-0.05)/2 = 0,25. For hver dose-respons vises brønnene ligger nærmest verdien med oransje.
Den øvre halvdelen av figur 9A viser resultatene fra trinn 2 føljetong dose-respons eksperiment. IC50 brønnene for LEV er kolonnen 10 i to gjentak, som tilsvarer 4 ng/mL. IC50 for endelig og PNG er på 3 µg/mL og 25 µg/mL, henholdsvis. Disse konsentrasjonene tilsvarer 1 x konsentrasjonen vist i figur 7B. Den nedre halvdelen av figur 9B viser resultatene fra trinn 3, lineær dose-respons eksperimenter. LEV, endelig og PNG er IC50 finnes på 0,4 x, 0.8 x og 1.2 x, henholdsvis. Disse konsentrasjonene tilordnes som 1 X IC50 i trinn 4.
To plater tilsvarer to replikere eksperimenter er vist i figur 9B, hvor IC50 brønner vises med oransje. Plate 1 har alle enkelt stoffer sine IC50 på 1 x konsentrasjonen. Den forventede IC50 for parvis eller treveis kombinasjonen beregnes av det aritmetiske gjennomsnittet for konstituerende narkotika, gjør forventet IC50 for alle kombinasjoner også 1 x konsentrasjon. Tallerken 2, LEV og PNG har sine IC50 på 1 x konsentrasjonen, men endelig IC50 er på 1.2 x. Den forventede IC50 for hver kombinasjon defineres med de aritmetiske gjennomsnittene av disse IC50-verdiene. Den forventede IC50 for LEV + Beholderforgreningen og endelig + PNG er for eksempel 1.1 x. Legemiddelinteraksjoner score (FIC) for hver kombinasjon blir beregnet ved å dele observert IC50 med den forventede IC50, som vist på høyre side av platene. Inspeksjon av FIC scorene til de to platene viser at LEV + Beholderforgreningen og LEV + Beholderforgreningen + PNG er synergistisk, LEV + PNG og endelig + PNG er antagonistiske. FIC resultater oppnådd i to platene er i avtalen, hjelper pålitelighet av protokollen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figur 1: Null modell definisjon for Loewe additivity narkotika samhandling modellen. To 5 x 5 matriser på en microplate, der narkotika A lineært økes i én akse som vist til venstre, og en topp konsentrasjon av narkotika hemmer en kvantifiserbare fenotypen (øverst til høyre). Tillegg av disse matriser vises i midten, der linjene som kobler sammen equipotent narkotika en konsentrasjonene i hvert enkelt legemiddel har samme konsentrasjonen som narkotika A. Når celler er lagt på denne "sjakkbrett" på konsentrasjon rusmiddelkombinasjoner, forventes det at registrerte fenotypen på linjen vil være tilsvarende brønner forbinder. I dette selv-selv narkotika samhandling eksperimentet, er isobole viser en fenotypen (vist med en stiplet grønn linje) forventet å være lineære, definere additivity null modellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figur 2: parvis interaksjoner etter Loewe additivity narkotika samhandling modellen. To stoffene er kombinert i en dambrett analysen som figur 1, kan observerte isophenotypic konturen være rett, konvekse eller konkav. Høyre, er mulig isophenotypic konturer (stiplet grønn linje) superimposed på sjakkbrett analyser. Rusmiddelkombinasjoner med rett isophenotypic konturer som Loewe-additiv, konturene ikke er forskjellig fra en self-selv legemiddelinteraksjoner, som er Loewe-a per definisjon. Når isophenotypic contour er betydelig konkav eller konveks, er kombinasjonen synergistisk eller antagonistiske, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figur 3: treveis interaksjoner etter Loewe additivity narkotika samhandling modellen. Ligner sjakkbrett analysen for parvis interaksjoner, tre-medikamenter kombineres i et 3D rutenett (en "checkercube"), der hvert legemiddel er lineært økt i én akse. Hvis de tre stoffene var identiske, er isophenotypic overflaten forventet å være flat, definere additivity for tre rusmiddelkombinasjoner. Hvis overflaten er mer konkav eller konveks enn denne Loewe-additiv null modellen, er rusmiddelkombinasjoner synergistisk eller antagonistisk, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figur 4: Diagonal metode for å måle parvis interaksjoner. For hver sjakkbrett analysen måles bare regionene vises i magenta rektangler. i og ii øker lineært enkelt stoff konsentrasjoner. III vurderes ved å gjøre en 1:1 blanding av to narkotika og lineært titrating denne blandingen som om det var et enkelt stoff. FIC er lik den observerte IC50 i kombinasjonen dividert med den forventede IC50 av to enkelt narkotika. For Loewe additivity modellen anslås den forventede IC50 med den gjennomsnittlige IC50 av to enkelt narkotika. FIC verdien 1 for Loewe-additiv par og lavere eller høyere enn 1 for synergistiske eller antagonistiske par,2,12henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figur 5: Diagonal metode for å måle treveis interaksjoner. For hver checkercube analysen måles bare områdene vist. i, ii og iii øker lineært enkelt stoff konsentrasjoner. IV måles ved å gjøre en 1:1:1 blanding av tre narkotika og lineært titrating denne blandingen som om det var et enkelt stoff. Den delvis inhibitoriske konsentrasjon er lik de observerte IC50 i kombinasjonen dividert med den forventede IC50 gitt tre enkelt narkotika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figur 6: arbeidsflyt for diagonal metoden protokollen beskrevet her og oppsettdetaljer for hver microplate. Platen i dag 4 er gjennomført i duplikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figur 7: serielle og lineær fortynning dose-respons eksperimenter. (A) utarbeidelse av føljetong fortynning dose-respons for ett stoff og tilsvarende siste narkotika konsentrasjoner. E. coli celler legges til plate; vekst registreres etter 16 h. seriell IC50, vises i oransje, velges for hvert legemiddel for bruk i dagen lineær fortynning dose-respons eksperimenter. (B) utarbeidelse av lineær fortynning dose-respons for ett stoff og tilsvarende siste narkotika konsentrasjoner. E. coli celler legges til plate; vekst registreres etter 16 h. For hvert legemiddel de valgte IC50s som skal brukes i neste dag legemiddelinteraksjoner eksperimenter vises i oransje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figur 8: narkotika samhandling eksperimenter. Utarbeidelsen av samhandling eksperimenter er lik enkelt stoff lineær dose-svar, bortsett fra at en 1:1 eller 1:1:1 blanding av legemidler brukes for to eller tre stoff dose-svar, henholdsvis. Observert IC50s for hver dose-respons, avbildet i oransje, brukes til å beregne FIC score. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figur 9: representant eksperimentere resultater. Representant resultatene ved hjelp av beskrevet protokollen vises, med detaljer i hovedteksten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonale metode for å måle synergi blant en rekke narkotika

I denne protokollen beskriver vi hvordan få Loewe additivity-baserte narkotika samhandling målinger for parvis og treveis rusmiddelkombinasjoner.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomisk Hybridisering (Array CGH) for deteksjon av Genomiske Kopier nummer Varianter

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ Immunfluorescens analysen Mål Variasjon i protein nivåer på Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Bruke plusTipTracker Programvare to Measure mikrotubulidynamikk i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vekst kjegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro-analyse for å måle Fosfatidyletanolaminsyntese metyltransferase aktivitet

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ tilnærming for prøveopparbeidelse med lav celle nummer for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Høy oppløsning Respirometry å måle mitokondrie funksjon av intakt Beta-cellene i nærvær av naturlige forbindelser

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...