Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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Este trabalho foi financiado pelo NIGMS Grant P50GM107618. Os autores agradecer Zohar B. Weinstein para as observações perspicazes e sugestões sobre o manuscrito.

Nota: Qualquer pequena molécula que inibe o crescimento de bactérias e. coli pode ser usada para o método diagonal. Neste protocolo, levofloxacina (LEV), ácido nalidíxico (NAL) e penicilina G (PNG) irão ser usado como um exemplo, já que estas drogas mostram uma sinergia de três vias saliente. O fluxo de trabalho do presente protocolo é mostrado como Figura 6. Realize todas as medidas à temperatura ambiente. Use o frescas alíquotas de bactérias e drogas cada dia. Realize o experimento sob níveis de biossegurança adequados para Escherichia coli.
1. etapas de preparação
<ol><li>Preparar a mídia de Luria-Bertani (LB) com a adição de 25 g de caldo LB para 1 L de água destilada e misturar. Autoclave a 121 ° C por 15 min e loja a mídia autoclavada à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar ações de glicerol de Escherichia coli , misturando volumes iguais de estéril 50% de glicerol e células bacterianas diluídas para OD600 = 1 caldo LB e congelar 150 alíquotas µ l em tubos de 1,5 mL microcentrifuga a-80 ° C.</li>
	<li>Dissolva 20 mg de antibióticos, LEV, NAL e PNG em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) cada. Dilua o LEV solução 100 x 0,2 µ g/ml misturando-se 10 µ l de solução LEV com 990 µ l de DMSO. Use LEV de 0,2 mg/mL e 20 mg/mL NAL e PNG nas etapas do processo.</li>
	<li>Alíquota 50 µ l de cada antibiótico para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e congelar a-20 ° C.</li>
	<li>Tome um 150 µ l alíquota de e. coli de-80 ° C. Degelo.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de estoque de glicerol de Escherichia coli em 5 mL de LB mídia em um tubo de cultura de 14 mL.</li>
	<li>Agite os tubos em uma incubadora de 37 ° C durante a noite a 200 rpm.</li>
</ol>2. serial diluição experimento de Dose-resposta
<ol><li>Tomar uma alíquota de drogas LEV, NAL e PNG de-20 ° C, deixá-los à temperatura ambiente durante 10 minutos descongelar e preparar diluições em série destas drogas.</li>
	<li>Prepare 1100 µ l da LB - 10% sol misturando 990 µ l de LB mídia e 110 µ l de solvente (DMSO).</li>
	<li>Prepare 500 µ l de LEV LB - 10% através da mistura de 450 µ l de LB mídia e 50 µ l de LEV.</li>
	<li>Sol de vórtice LB - 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicione 20 µ l de sol LB - 10% para as linhas top 4 dos poços de uma microplaca de 96 poços.</li>
	<li>Vórtice LEV LB - 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicionar 20 µ l de LEV LB - 10% para o primeiro poço em linha A.</li>
	<li>Prepare-se dupla diluição serial Lev LB - 10%, tendo 20 µ l do primeiro poço, adicionando ao segundo poço, pipetagem e descer cinco vezes. Repita isto para todos os poços sequencialmente até 11 bem, que acaba com 40 µ l (Figura 7A).</li>
	<li>Remova e descarte a 20 µ l do conteúdo da 11ª bem, usando uma micropipeta.</li>
	<li>Repita as etapas 2.3-2.7 para as drogas NAL e PNG usando as segunda e terceiros linhas do microplate, respectivamente.</li>
	<li>Repita as etapas de 2,3-2,7 pela droga LEV novamente na quarta linha como um controle positivo interno.</li>
	<li>Usando um spectrophotometer, medir o OD600 de um 01:10 diluição da cultura (etapas 1.5-1.7).</li>
	<li>Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta multicanal, adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições de série drogas preparadas no passo 2.4-2.9. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7A. A placa para evitar a evaporação do selo.</li>
	<li>Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Inicie uma nova cultura bacteriana usar na etapa 3 (repita etapas 1.5-1.7).</li>
</ol>3. linear diluição experimento de Dose-resposta
<ol><li>Medir a absorvância de600 OD para placa de dose-resposta de diluição serial da etapa 2, usando um leitor de placas (Figura 7A certo) e interpretar os resultados com base nas etapas seguintes.</li>
	<li>Normalizar o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle nenhuma droga para cada linha e calcular o crescimento percentual normalizando OD600a condição nenhuma droga.</li>
	<li>Para cada droga, localize os poços que têm inibição do crescimento de ~ 50% (IC50), mostrada em laranja na Figura 7A certo. Atribua a concentração nesses poços como "IC50 serial" para cada droga.</li>
	<li>Descongelar as alíquotas de droga fresca, prepare-se 1 mL de LB - 10% sol misturando LB mídia e solvente (DMSO) em uma proporção de 9:1 e LB - 10% drogas misturando LB mídia e drogas na proporção de 9:1, onde a concentração da droga é 100 x de serial IC50 do cada droga antes de adicionar a mídia LB , escolhido no passo 3.3.</li>
	<li>Prepare-se linearmente crescentes doses de drogas LEV, NAL e PNG 11 concentrações, misturando drogas LB - 10% e sol LB - 10% em volumes, mostrado na Figura 7B.</li>
	<li>Prepare-se linearmente crescentes doses de LEV na quarta linha como um controle positivo interno.</li>
	<li>Medir o OD600 das 01:10 diluição da cultura começou na etapa 2.14.</li>
	<li>Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório.</li>
	<li>Adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições linear de drogas preparadas na etapa 3.6 utilizando uma micropipeta multicanal. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7B. Nota: O meio bem na dose-resposta receberá o serial IC50 para esta droga. A placa do selo para evitar a evaporação.</li>
	<li>Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Começa duas culturas bacterianas frescas para usar na etapa 4 (repita etapas 1.5-1.7).</li>
</ol>4. experimento de interação droga diagonal
<ol><li>Medir a absorvância de600 OD por diluição linear dose-resposta de etapa 3 (Figura 7B).</li>
	<li>Para cada droga, escolha a concentração que resultaram em IC50 e prepara droga LEV, NAL e PNG em 100 x IC50 concentrações.</li>
	<li>Descongelar as drogas frescas, preparar 100 x IC50 para cada droga e preparar misturas de drogas de 1:1 em volume de LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e 1: mistura de droga de 1:1 em volume de LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Prepare duas placas para experiências de interação de droga como mostrado na Figura 8.</li>
	<li>Medir o OD600 das 01:10 diluição das culturas começou na etapa 3.11.</li>
	<li>Preparar OD600 = 0,01 diluições de duas culturas em duas 10 mL de LB mídia.</li>
	<li>Adicione 80 µ l de células da cultura 1 e 2 em placas 1 e 2, respectivamente. Sele as placas para evitar a evaporação. Incubar as placas durante 16 h a 37 ° C.</li>
</ol>5. golo de interação droga diagonal
<ol><li>Medida da absorvância de600 OD para interação medicamentosa diagonal experimentar pratos da etapa 4.</li>
	<li>Normalize o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle de drogas não bem para cada linha.</li>
	<li>Para cada linha, localize a coluna que tem mais próximo de IC50, mostrado em laranja na Figura 8 certa inibição do crescimento. Atribua o IC50 baseada a concentração relativa de droga nesta bem.</li>
	<li>Para LEV + NAL, NAL + PNG e LEV + NAL + PNG dose-respostas e LEV + PNG, calcule IC50 esperado calculando o IC50 das drogas em cada combinação única. Observe que em média é uma aproximação simples para cálculo exato de IC50 esperado conforme descrito antes12.</li>
	<li>Calcule o golo de concentração inibitória fracional (FIC), dividindo o IC50 observados pelo IC50 esperada em cada combinação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O uso de combinações de drogas contra patógenos ou tumores é uma perspectiva atraente, especialmente sob as circunstâncias de antibiótico pipeline de secagem. No entanto, este potencial é dificultado pelo menos duas dificuldades. A primeira dificuldade é o número astronômico de combinações possíveis. Existem, por exemplo, 4950 combinações possíveis de pares entre 100 antibióticos. Todas as combinações possíveis entre 100 antibióticos (2100) está na mesma ordem de magnitude, com o número de bactérias na terra (10 ~30). Como prever combinações fortemente sinérgicas entre essas possibilidades tem sido objecto de numerosos estudos computacionais. A segunda dificuldade é a medição de interações medicamentosas de alta ordem. Considere que uma plataforma computacional pode sugerir que uma determinada combinação de droga-10 é fortemente sinérgica contra um determinado patógeno. Métodos tradicionais para testar interações medicamentosas é demasiado onerosa para verificar ou refutar esta hipótese, portanto, o estudo da sinergia entre muitos medicamentos tem sido fora dos limites da investigação científica. O método diagonal, o que foi proposto pela primeira vez há quase 30 anos e foi usado em algumas telas de sinergia recentes fornecem uma base sólida para o primeiro problema, permitindo o teste da interação entre muitos pares. Ele resolve o problema segundo uma amostragem informativa dos ensaios tradicionais e permite o estudo das interações medicamentosas de alta ordem.
Importante notamos que nosso protocolo usa uma dosagem linear para medições de interação de drogas, para fornecer a sensibilidade para detectar até mesmo interações fracas. Estabelecer o intervalo de concentração certa para dosagem linear é uma tarefa desafiadora. Realizando primeiro uma diluição serial, podemos tomar uma decisão informada sobre o espaço de busca para dosagem linear. No entanto, o protocolo pode ser modificado para usar 2 dobras ou maiores diluições em série para testes de interação de drogas. Essa modificação pode encurtar o tempo de experiência e permitem que o teste de interações mais; no entanto, teria sensibilidade para detectar interações apenas fortemente sinérgicas ou antagônicas.
O protocolo descrito mostra a medição de interações emparelhadas ou três vias. Um aspecto importante do protocolo é que agentes único são no mesmo prato como a combinação, para minimizar o viés devido às variações do prato. Portanto, o protocolo pode ser ajustado para medir interações até 7 vias combinações por modificações triviais. Combinações de mais de 7 drogas vão exigir mais de uma microplaca de 96 poços e considerações adicionais devem ser tomadas para garantir a integração de dados corretos, tais como repetições inter plate.
Uma notável limitação do método diagonal é a restrição que cada droga no ensaio deve inibir o fenótipo de interesse. Portanto, o método diagonal não é útil para a compreensão das interacções entre agentes ativos e adjuvantes inertes. Tais interações 'potencializadora' podem ser estudadas sob modelos alternativos tais como modelos de felicidade ou maior agente único.
Uma consideração importante para a análise de interações medicamentosas de ordem superior é a escolha do modelo nulo para o "IC50 esperado." Quando duas drogas são combinadas, o efeito da combinação só pode ser comparado aos efeitos da droga. Quando três drogas são combinadas, o efeito da combinação pode ser comparado ao único efeitos ou efeitos emparelhados. Por exemplo, se todas as combinações emparelhadas de três drogas são sinérgicas, então ser de esperar que estas drogas mostrará uma sinergia de três vias. Desvio de uma interação três vias do que é esperado de interações emparelhadas foi recentemente apelidado "interação emergente"16,17. Para simplificar, nosso protocolo descreve a medição da combinação de três vias está "líquido interação," que define o modelo nulo como efeitos de droga. No entanto, os dados que são obtidos a partir do protocolo também podem ser usados para calcular a interação emergente da combinação de três vias. Em nossa análise, definimos o esperado IC50 da combinação de três vias como a média da única droga IC50s. Alternativamente, o IC50 esperado pode ser definido como a média da IC50s de combinações emparelhadas (~1.1-1.2). Quando o IC50 observada é dividido por esta alternativa IC50 esperado, o FIC obtido fornece o FIC emergente para a combinação de três vias, como descrito anteriormente,12. Esta consideração revela que LEV + NAL + PNG é sinérgica mais do que o que seria de esperar de emparelhadas interações entre três drogas, demonstrando que o LEV + NAL + PNG tem sinergia emergente.

Combinações de drogas podem apresentar efeito surpreendentemente alto ou baixo em um fenótipo dado os efeitos das drogas constituintes, correspondente a interações medicamentosas sinérgicas ou antagônicas, respectivamente,1,2,3. O uso de combinações sinérgicas pode permitir dose-escalonamento para aumento da eficácia e redução de dose para alívio de efeito colateral. Tratamentos de combinação podem igualmente aplicar vários contratempos a maquinaria celular, bloqueando potenciais mecanismos de fuga evolutiva para resistência4. Portanto, as combinações de três ou mais drogas são rotineiramente usadas em patógeno ou câncer tratamento5.
Sinergia e antagonismo são definidos por uma comparação entre os efeitos observados de uma combinação contra um efeito esperado, tendo em conta os efeitos de drogas individuais. Entre os modelos para interações medicamentosas, aditividade Loewe é a mais exigente e tem um modelo bem definido nulo (Figura 1)6, e a interação de sinergia/antagonismo inferido é independente da concentração da droga usada 6 , 7. no entanto, o modelo de Loewe é experimentalmente caro mesmo para um teste de interação emparelhadas. Ensaios de interação droga tradicionalmente são compostos por uma matriz 2D de combinações de concentração da droga (um ensaio de quadriculado) (Figura 2). 5 doses são usados para cada droga, se 25 combinações são necessárias, correspondente a uma metade de uma microplaca se são conduzidos experimentos em replicar. O custo desta abordagem proíbe medição sinergia pelo modelo de aditividade da Loewe para combinações de múltiplas drogas (Figura 3). Por exemplo, para testar uma 10-forma interação, métodos tradicionais exigiria mais de 100 mil microplacas, barrando a medição experimental de alta-ordem sinergias pelo modelo de aditividade Loewe rigoroso, bem teorizado e independente de concentração 8.
Tratamentos clínicos atuais utilizam apenas uma fração de combinações de drogas possíveis. Por exemplo, o tratamento padrão da tuberculose activa é uma combinação de três antibióticos. Existem aproximadamente 20 antibióticos usados no tratamento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Há combinações possíveis de 3 vias 1140 entre 20 drogas, cada um com potencial para ter uma forte sinergia contra Mtb. Como não houve nenhum método cost-effective para medir as interações medicamentosas entre muitas drogas, combinações sinergéticas potencialmente salva-vidas permanecem não testadas.
Aqui, descrevemos um protocolo simples para medir interações medicamentosas emparelhadas e três vias por amostragem somente a diagonal de um ensaio de xadrez (,Figura 4 e Figura 5). O conceito subjacente de amostragem da diagonal de um experimento de xadrez foi teorizado por Berenbaum em sua obra seminal em 19789. Ainda, esta abordagem só recentemente tem sido aplicada a droga sinergia telas10,11,12. Apresentamos o nosso protocolo com Escherichia coli (e. coli) e o fenótipo de crescimento. No entanto, notamos que o protocolo é independente das espécies biológicas e fenótipo de interesse e, portanto, pode ser aplicado para a medição da sinergia de drogas de alta ordem em outros contextos biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Uma combinação sinérgica de drogas tem uma eficácia maior em comparação com os efeitos das drogas individuais. Ensaios de tabuleiro de damas, onde drogas são combinadas em doses muitos, permitam a medição sensível de interações medicamentosas. No entanto, estes ensaios são caros e não se adapta bem para medir a interação entre muitos medicamentos. Vários estudos recentes têm relatado as medições de interação de drogas usando uma amostragem diagonal do ensaio do xadrez tradicional. Esta metodologia alternativa grandemente diminui o custo das experiências de interação de drogas e permite a medição de interação para combinações com muitas drogas. Aqui, descrevemos um protocolo para medir as três interações emparelhadas e uma interação de três vias entre três antibióticos em duplicado, em cinco dias, usando apenas três microplacas de 96 poços e equipamentos de laboratório padrão. Apresentamos resultados representativos, mostrando que a combinação de três-antibiótico da penicilina G + Levofloxacina + ácido nalidíxico é sinérgica. Nosso protocolo escalas medir as interações entre muitas drogas e em outros contextos biológicos, permitindo a telas eficientes para múltiplas drogas sinergias contra patógenos e a tumores.

Anteriormente, informamos as interações emparelhadas entre três drogas: LEV, NAL e PNG com base em testes em ensaios miniaturizados quadriculado, onde duas drogas foram combinadas em uma matriz 4 x 413,14. Enquanto NAL e LEV foram sinérgicos, PNG foi relatado para ser antagônico com tanto LEV e NAL de13,14. Aqui, verificamos essas interações emparelhadas e medido a interação de três vias entre estas três drogas usando um ensaio diagonal. Nossos resultados demonstram que o LEV + NAL + PNG é uma combinação sinérgica de antibiótica 3 vias. Representações esquemáticas para os resultados das seções individuais procedimento experimental foram dadas no lado direito da Figura 7 e Figura 8. Aqui, apresentamos e interpretar resultados brutos representativos de três leituras de placa, que são dadas na Figura 9. A leitura da placa superior corresponde à diluição serial e linear experimentos conduzidos em etapas 2 e 3. As duas leituras de placa inferior são placas duplicadas interação realizadas na etapa 4.
Os dados brutos na Figura 9 mostram que crescimento superior é em torno de 0,55, mas há uma densidade óptica 0,05 da mídia em si, como observado no OD600 das concentrações alta drogas onde não há nenhum crescimento. Portanto, definimos IC50 como (0.55-0.05)/2 = 0,25. Para cada dose-resposta, os poços localizados mais próximo a este valor são mostrados com laranja.
A metade superior da Figura 9A mostra os resultados da etapa 2, experimento serial dose-resposta. Os poços de IC50 para LEV é em repetições de 10 em duas colunas, que correspondem a 4 ng/mL. O IC50 para NAL e PNG estão a 3 µ g/mL e 25 µ g/mL, respectivamente. Essas concentrações correspondem à concentração de 1 x indicado na Figura 7B. A metade inferior da Figura 9B mostra os resultados da etapa 3, experimentos dose-resposta linear. LEV, NAL e IC50 do PNG encontram-se em 0,4 x, x 0.8 e 1.2 x, respectivamente. Essas concentrações são atribuídas como o 1 X IC50 para etapa 4.
Duas placas correspondente ao replicar dois experimentos são mostrados na Figura 9B, onde o IC50 poços são mostradas com laranja. Em chapa de 1, todos os medicamentos simples têm seu IC50 na concentração de 1 x. O IC50 esperados para a combinação de emparelhadas ou ménage é calculado pela média aritmética das drogas constituintes, tornando IC50 esperado para concentração de 1x também todas as combinações. Em chapa 2, LEV e PNG têm seu IC50 na concentração 1 x, mas NAL IC50 é de 1.2 x. O IC50 esperados para cada combinação é definida utilizando a média aritmética destes valores de IC50. Por exemplo, o esperado IC50 para LEV + NAL e NAL + PNG é 1.1 x. A interação de droga marcar (FIC) para cada combinação é calculada dividindo-se observado IC50 com o IC50 esperados, como mostrado no lado direito das placas. Inspeção das pontuações das duas placas FIC demonstra que LEV + NAL e LEV + NAL + PNG são sinérgicas, enquanto LEV + PNG e NAL + PNG são antagônicas. FIC somatória de pontos atribuídas as duas placas está de acordo, a confiabilidade do protocolo de apoio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figura 1: Null definição de modelo para modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. 5 x duas 5 matrizes em uma microplaca, onde drogas A linearmente é aumentada em um eixo, como mostrado à esquerda, e uma alta concentração de fármaco inibe um fenótipo quantificável (superior direito). A adição destas matrizes é mostrada no meio, onde as linhas conectando equipotent droga um concentrações em cada única droga tem a mesma concentração que droga A. Quando as células são adicionadas a este "tabuleiro de damas" de combinações de concentração de drogas, espera-se que o fenótipo gravado nesta linha será equivalente para os poços que se conecta. Neste experimento de interação droga autoauto, o isobole representando um fenótipo (mostrado com uma linha tracejada verde) é esperado para ser linear, definindo o modelo de aditividade nula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figura 2: interações de droga emparelhadas, de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Quando dois medicamentos são combinados em um ensaio de xadrez, como na Figura 1, o contorno de isophenotypic observado pode ser em linha reta, convexa ou côncava. À direita, isophenotypic possíveis contornos (linhas tracejadas verdes) são sobrepostos em ensaios de tabuleiro de damas. Combinações de drogas com contornos isophenotypic reta são Loewe-aditivo, como os contornos não são diferentes de uma interação de droga autoauto, que é a Loewe-aditivo por definição. Quando o contorno de isophenotypic significativamente é côncavo ou convexo, a combinação é sinérgica ou antagônica, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figura 3: interações medicamentosas de três vias de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Semelhante para o ensaio de quadriculado para interações emparelhadas, três-drogas são combinadas em uma grade 3D (um "checkercube"), onde cada droga linearmente é aumentada em um eixo. Se as três drogas eram idênticas, isophenotypic superfície deve ser plana, definindo a aditividade para três combinações de drogas. Se a superfície é mais côncava ou convexa que este modelo nulo Loewe-aditivo, combinações de drogas são sinérgicas ou antagônicas, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figura 4: método Diagonal para medir interações medicamentosas emparelhadas. Para cada ensaio de tabuleiro de damas, medem-se apenas as regiões mostradas em retângulos magenta. i e ii são linearmente única droga concentrações crescentes. III é avaliada, fazendo uma mistura 1:1 de dois medicamentos e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A FIC é igual ao IC50 observados na combinação dividida pelo esperado IC50 de duas drogas única. Para o modelo de aditividade de Loewe, o esperado IC50 é aproximada pelo IC50 média das duas drogas única. Um valor FIC é 1 para pares de Loewe-aditivo e é inferior ou superior a 1 para os pares sinérgicas ou antagônicas, respectivamente2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figura 5: método Diagonal para medir interações medicamentosas ménage. Para cada ensaio de checkercube, apenas as regiões mostradas são medidas. i, ii e iii são linearmente única droga concentrações crescentes. IV é medido por fazendo um 1:1:1 mistura de três drogas e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A concentração inibitória fracional é igual ao observado IC50 na combinação dividida pelo IC50 esperado dado três drogas única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figura 6: fluxo de trabalho para o protocolo do método diagonal aqui descritos e os detalhes de configuração para cada microplacas. A placa mostrada no dia 4 é conduzida em duplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figura 7: experimentos dose-resposta de diluição Serial e linear. (A) preparação da diluição serial dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é gravado após 16 h. IC50 Serial, mostrado em laranja, é selecionado para cada droga para uso no dia seguinte é linear experimentos dose-resposta de diluição. (B) preparação da diluição linear dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é registrado após 16 h. Para cada droga, o selecionado IC50s que será usado do dia seguinte drogas interação experimentos são mostrados em laranja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figura 8: experiências de interação de drogas. Preparação de experiências de interação é a única droga linear dose-respostas semelhantes, exceto que um 1:1 ou 1:1:1 mistura de drogas é usada para dois ou três droga dose-respostas, respectivamente. Observada IC50s para cada dose-resposta, retratado em laranja, são usados para calcular o golo de FIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figura 9: representante experimentar resultados. São mostrados resultados representativos obtidos usando o protocolo descrito, com pormenores fornecidos no texto principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Método diagonal medida sinergia entre qualquer número de drogas

Neste protocolo, descrevemos como fazer Loewe medições de interação de drogas baseadas em aditividade para pairwise e combinações de drogas de três vias.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

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