Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Detta arbete finansierades av NIGMS Grant P50GM107618. Författarna vill tacka Zohar B. Weinstein för förslag på manuskriptet och insiktsfulla kommentarer.

Obs: Någon liten molekyl som hämmar tillväxt av E. coli -bakterier användas för metoden diagonal. I detta protokoll, levofloxacin (LEV), används nalidixic syra (NAL) och Penicillin G (PNG) som ett exempel, eftersom dessa läkemedel visar en salient tre-vägs synergi. Arbetsflödet i detta protokoll visas som figur 6. Utföra alla steg i rumstemperatur. Använd färska alikvoter av bakterier och droger varje dag. Utför experimentet under biosäkerhet nivåer som är avpassade för E. coli.
1. förberedelser
<ol><li>Förbered Luria-Bertani (LB) genom att lägga till 25 g LB buljong 1 L destillerat vatten och blanda. Autoklav vid 121 ° C i 15 min och butik Ånghärdad media vid rumstemperatur.</li>
	<li>Förbered E. coli glycerol bestånd genom att blanda lika stora volymer av sterila 50% glycerol och bakterieceller som spätts till OD600 = 1 i LB buljong och frysa 150 µL portioner i 1,5 mL mikrocentrifugrör vid-80 ° C.</li>
	<li>Lös 20 mg av antibiotika, LEV, NAL och PNG i 1 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO) varje. Späd LEV lösning 100 x 0,2 µg/ml genom att blanda 10 µL LEV lösning med 990 µL av DMSO. Använd 0,2 mg/mL LEV och 20 mg/mL NAL och PNG i förfarandet steg.</li>
	<li>Alikvotens 50 µL av varje antibiotika 1,5 mL mikrocentrifugrör och frysa vid-20 ° C.</li>
	<li>Ta en 150 µL alikvot av E. coli från-80 ° C. Tina.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL av E. coli glycerol lager i 5 mL LB media i en 14 mL kultur tub.</li>
	<li>Skaka rören i en 37 ° C inkubator övernattning på 200 rpm.</li>
</ol>2. seriell utspädning dos-respons Experiment
<ol><li>Ta en alikvot av narkotika LEV, NAL och PNG från-20 ° C, lämna dem i rumstemperatur i 10 min till Tina och förbereda för seriespädningar av dessa läkemedel.</li>
	<li>Förbereda 1100 µL LB - 10% sol genom att blanda 990 µL av LB media och 110 µL av lösningsmedel (DMSO).</li>
	<li>Förbereda 500 µL av LB - 10% LEV genom att blanda 450 µL av LB media och 50 µL av LEV.</li>
	<li>Vortex LB - 10% sol för 5 s vid den högsta inställningen. Tillsätt 20 µL av LB - 10% sol de fyra översta raderna av brunnar i en 96 brunnar mikroplattan.</li>
	<li>Vortex LB - 10% LEV för 5 s vid den högsta inställningen. Tillsätt 20 µL av LB - 10% LEV i den första brunnen i rad A.</li>
	<li>Förbereda tvåfaldiga seriella utspädning för LB - 10% LEV genom att ta 20 µL från den första brunnen, lägga till andra brunnen, pipettering upp och ner fem gånger. Upprepa detta för alla brunnar sekventiellt tills den 11: e väl, som slutar med 40 µL (figur 7A).</li>
	<li>Avlägsna och kassera 20 µL av innehållet från den 11: e väl, med hjälp av en mikropipett.</li>
	<li>Upprepa steg 2,3-2,7 för drogerna NAL och PNG använder de andra och tredje raderna av mikroplattan, respektive.</li>
	<li>Upprepa steg 2,3-2,7 för drogen LEV igen på fjärde raden som intern positiv kontroll.</li>
	<li>Med en spektrofotometer, mäta OD600 på en 1:10 utspädning av kulturen (steg 1,5-1,7).</li>
	<li>Späd cellerna i 5 mL LB media till en OD600 0,01. Häll i en reservoar.</li>
	<li>En flerkanalig mikropipett Lägg till 80 µL utspädda celler till de drog seriespädningar som bereddes i steg 2,4-2,9. De slutliga läkemedelskoncentrationen i varje brunn visas i figur 7A. Försegla plattan för att förhindra avdunstning.</li>
	<li>Inkubera plattan för 16 timmar vid 37 ° C.</li>
	<li>Starta en ny bakterieodling använda i steg 3 (Upprepa steg 1,5-1,7).</li>
</ol>3. linjära utspädning dos-respons Experiment
<ol><li>Mät OD600 absorbansen för seriell utspädning dos-respons tallrik från steg 2 med hjälp av en tallrik läsare (figur 7A rätt) och tolkar resultaten utifrån följande steg.</li>
	<li>Normalisera tillväxten genom att dividera ökningen av varje brunn med tillväxten i ingen drog kontrollen för varje rad och beräkna procentuell tillväxt av normalisera OD600till inga läkemedel villkor.</li>
	<li>Leta upp de brunnar som har ~ 50% tillväxthämning (IC50), visas i orange i figur 7A rättför varje läkemedel. Tilldela koncentrationen i dessa brunnar som ”serial IC50” för varje läkemedel.</li>
	<li>Tina färska drog alikvoter, förbereda 1 mL LB - 10% sol genom att blanda LB media och spädningsvätska (DMSO) i ett förhållandet 9:1 och LB - 10% läkemedel genom att blanda LB media och drog i en 9:1-förhållande, där läkemedlets koncentration är 100 x av varje drogens seriell IC50 innan du lägger till LB media , som valdes i steg 3.3.</li>
	<li>Förbered linjärt ökande doser narkotika LEV, NAL och PNG i 11 koncentrationer, genom att blanda LB - 10% drog- och LB - 10% sol i volymer som visas i figur 7B.</li>
	<li>Förbereda linjärt ökande doser av LEV på fjärde raden som intern positiv kontroll.</li>
	<li>Mäta den OD600 av 1:10 utspädning av kulturen startade steg 2.14.</li>
	<li>Späd cellerna i 5 mL LB media till en OD600 0,01. Häll i en reservoar.</li>
	<li>Tillsätt 80 µL utspädda cellerna på de drogen linjär utspädningar som bereddes i steg 3.6 använder en flerkanalig mikropipett. De slutliga läkemedelskoncentrationen i varje brunn visas i figur 7B. Obs: Mitten väl i dos-respons får följetong IC50 för denna drog. Täta platta för att förhindra avdunstning.</li>
	<li>Inkubera plattan för 16 timmar vid 37 ° C.</li>
	<li>Starta två färska bakteriekulturer använda i steg 4 (Upprepa steg 1,5-1,7).</li>
</ol>4. diagonal drog interaktion Experiment
<ol><li>Mät OD600 absorbansen för linjär utspädning dos-respons från steg 3 (figur 7B).</li>
	<li>För varje läkemedel, välja den koncentration som resulterade i IC50 och förbereda drug LEV, NAL och PNG i 100 x IC50 koncentrationer.</li>
	<li>Tina upp färska droger, förbereda 100 x IC50 för varje läkemedel och förbereda 1:1 drog blandningar av LEV + NAL, LEV + PNG och NAL + PNG och 1:1:1 drog blandning av LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Förbered två plattor för läkemedlet interaktion experiment som visas i figur 8.</li>
	<li>Mäta den OD600 av 1:10 utspädning av kulturerna började i steg 3.11.</li>
	<li>Förbereda OD600 = 0,01 utspädningar av två kulturer i två 10 mL LB media.</li>
	<li>Tillsätt 80 µL av celler från kultur 1 och 2 på tallrikar 1 och 2, respektive. Förslut plattorna för att förhindra avdunstning. Inkubera plattorna för 16 timmar vid 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonal drog interaktion noter
<ol><li>Åtgärd OD600 absorbansen för diagonal läkemedelsinteraktion experimentera tallrikar från steg 4.</li>
	<li>Normalisera tillväxten genom att dividera ökningen av varje brunn med tillväxten i den ingen narkotikakontroll väl för varje rad.</li>
	<li>Leta upp den kolumn som har tillväxthämning närmast IC50, visas i orange i figur 8 höger för varje rad. Tilldela IC50 baserat på den relativa koncentrationen av drogen i detta väl.</li>
	<li>Beräkna förväntade IC50 för LEV + NAL, LEV + PNG och NAL + PNG och LEV + NAL + PNG dos-respons, genomsnitt IC50 av de enda läkemedel i varje kombination. Observera att i genomsnitt är en enkel approximation för exakt beräknade IC50 beräkning som beskrivs innan12.</li>
	<li>Beräkna fraktionerad hämmande koncentration (FIC) värderingar genom att dividera den observerade IC50 av förväntade IC50 i varje kombination.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Användning av läkemedelskombinationer mot patogener eller tumörer är en attraktiv möjlighet, särskilt under omständigheter av rörledningen snabbtorkande antibiotika. Denna potential hämmas dock av minst två svårigheter. Den första svårigheten är astronomiska antalet möjliga kombinationer. Det finns till exempel 4950 möjliga parvisa kombinationer bland 100 antibiotika. Alla möjliga kombinationer bland 100 antibiotika (2100) är av samma storleksordning med antalet bakterier på jorden (~ 1030). Hur man förutsäga starkt synergistiska kombinationer bland dessa möjligheter har varit föremål för talrika computational studier. Den andra svårigheten är mätning av hög-order läkemedelsinteraktioner. Anser att en computational plattform får föreslå att en viss 10-drogen kombination är starkt synergistisk mot vissa patogener. Traditionella metoder för att testa läkemedelsinteraktioner är för kostsamt att bekräfta eller vederlägga denna hypotes, studiet av synergi mellan många droger har därför varit utanför gränserna för vetenskaplig undersökning. Metoden diagonal, som först föreslogs nästan 30 år sedan och användes i några nyligen synergy skärmar ger en stark grund för det första problemet, genom att låta testning av interaktionen mellan många par. Det löser det andra problemet genom en informativ provtagning av de traditionella analyserna och tillåter studier av hög-order läkemedelsinteraktioner.
Vi noterar viktigast att våra protokoll använder en linjär dosering för läkemedlet interaktion mätningar, för att tillhandahålla känslighet för att upptäcka även svaga interaktioner. Upprättandet av rätt koncentration intervallet för linjär dosering är en utmanande uppgift. Genom att först utföra en seriell utspädning, fatta vi ett välgrundat beslut om Sök utrymme för linjär dosering. Dock protokollet kan ändras för att använda 2-faldig eller högre seriespädningar för läkemedel interaktion testning. En sådan ändring skulle förkorta tid som experiment och tillåter testning av fler interaktioner; Det skulle dock ha känslighet att upptäcka bara starkt synergistiska eller antagonistiska interaktioner.
Det protokoll som vi beskrivit visar mätningen av parvisa eller trevägs interaktioner. En kritisk aspekt av protokollet är att enda agenter är på samma platta som kombinationen, att minimera bias på grund av plattan variationer. Därför kan protokollet justeras för att mäta interaktioner upp till 7-vägs kombinationer av triviala modifieringar. Kombinationer av fler än 7 läkemedel kräver mer än en 96 brunnar mikroplattan och ytterligare överväganden måste vidtas för att säkerställa korrekta dataintegration, exempelvis mellan plate replikat.
En betydande begränsning av metoden diagonal är begränsningen att varje läkemedel i analysen måste hämma fenotypen av intresse. Diagonal metoden är därför inte användbart för förstå samspelet bland aktiva agenter och inert tillsatser. Sådana 'förstärkande' interaktioner kan studeras under alternativa modeller såsom Bliss eller högsta monoterapi modeller.
En viktig faktor för analys av högsta läkemedelsinteraktioner är null modell val för det ”förväntade IC50”. När två läkemedel kombineras, kan kombinationens effekt endast jämföras med de enda läkemedelseffekter. När tre läkemedel kombineras, kan kombinationens effekt jämföras med de enda effekter eller parvisa effekter. Exempelvis om alla parvisa kombinationer av tre läkemedel är synergistisk, kan sedan det förväntas att dessa läkemedel kommer att visa en tre-vägs synergi. En tre-vägs interaktionens avvikelse från vad som förväntas av parvisa interaktioner har kallats nyligen ”framväxande interaktion”16,17. För enkelhetens skull beskriver våra protokollet mätning av trevägs kombinationens ”net interaktionen”, som definierar den null modellen som enda läkemedelseffekter. De data som erhålls från protokollet kan dock också användas för att beräkna framväxande växelverkan av kombinationen trevägs. I vår analys definierat vi förväntade IC50 hos kombinationen tre sätt som genomsnittet av enda drogen IC50s. Alternativt kan förväntad IC50 definieras som genomsnittet av IC50s av parvisa kombinationer (~1.1-1.2). När den observerade IC50 divideras med denna alternativa förväntade IC50, föreskrivs den erhållna FIC den framväxande FIC trevägs kombinationen, som tidigare beskrivits12. Detta övervägande avslöjar att LEV + NAL + PNG är mer synergistisk än vad som skulle förväntas från parvisa interaktioner bland tre droger, visar att LEV + NAL + PNG har emergent samverkan.

Läkemedelskombinationer kan uppvisa överraskande hög eller låg effekt på en fenotyp som gett effekterna av konstituerande droger, motsvarar synergistiska eller antagonistiska läkemedelsinteraktioner, respektive1,2,3. Användning av synergistiska kombinationer kan dosen-eskalering för effekt ökning och dosreduktion för bieffekt lättnad. Kombinationsbehandlingar kan även gälla flera bakslag cellulära maskineriet, vilket förhindrar potentiella evolutionära fly mekanismer till motstånd4. Kombinationer av tre eller fler läkemedel används därför rutinmässigt i patogen eller cancer behandling5.
Synergi och antagonism definieras genom en jämförelse mellan den observerade effekten av en kombination kontra förväntad effekt ges enskilda läkemedelseffekter. Bland modellerna för läkemedelsinteraktioner, Loewe additivitet är de strängaste har en väldefinierad null modell ()figur 1)6och antagna synergy/antagonism samspelet är oberoende av den drog koncentration som används 6 , 7. dock Loewe modellen är experimentellt kostsamt även för en parvisa interaktionstest. Läkemedlet interaktion analyser består traditionellt av en 2D matris av läkemedelskombinationer koncentration (en schackrutiga assay) ()figur 2). Om 5 doser används för varje läkemedel, då 25 kombinationer krävs, motsvarar en halv av en mikroplattan om experiment utförs i replikera. Kostnaden för detta tillvägagångssätt förbjuder synergy mätning av Loewe additivitet modell för flera läkemedelskombinationer ()figur 3). Till exempel för att testa ett 10-vägs interaktion, skulle traditionella metoder kräva mer än 100 tusen mikroplattor, spärra experimentell mätning av hög-beställning synergier av stränga, väl theorized och koncentration-oberoende Loewe additivitet modell 8.
Aktuella kliniska behandlingar utnyttja endast en bråkdel av eventuella läkemedelskombinationer. Standardbehandling av aktiv tuberkulos är exempelvis en kombination av tre antibiotika. Det finns cirka 20 antibiotika som används inom Mycobacterium tuberculosis (Mtb) behandling. Det finns 1140 möjliga 3-vägs kombinationer bland 20 droger, alla med potential att ha en stark samverkan mot Mtb. Eftersom det har ingen kostnadseffektiv metod för att mäta läkemedelsinteraktioner bland många läkemedel, förbli potentiellt livräddande synergistiska kombinationer otestade.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att mäta parvisa och trevägs läkemedelsinteraktioner genom provtagning endast diagonalen av en schackrutiga assay ()figur 4 och figur 5). Det underliggande begreppet provtagning diagonalen av en schackrutiga experiment var teoretiserade av Berenbaum i hans banbrytande arbete i 19789. Detta tillvägagångssätt har ännu, först nyligen tillämpats till drogen synergy skärmar10,11,12. Vi presenterar våra protokoll med Escherichia coli (E. coli) och tillväxt fenotypen. Vi noterar dock att protokollet är oberoende av biologiska arter och fenotyp av intresse, och därmed kan användas för mätning av högsta drogen synergy i andra biologiska sammanhang.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

En synergistisk drog kombination har en högre effekt jämfört med effekterna av enskilda läkemedel. Schackrutiga analyser, där droger kombineras i många doser, möjliggöra känsliga mätning av läkemedelsinteraktioner. Men dessa analyser är kostsamma och skala inte väl för att mäta interaktionen mellan många läkemedel. Flera färska studier har rapporterat drog interaktion mätningar med en diagonal provtagning av traditionella Schackrutor analysen. Denna alternativa metod kraftigt minskar kostnaden för läkemedlet interaktion experiment och tillåter interaktion mätning för kombinationer med många läkemedel. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta de tre parvisa interaktionerna och en tre-vägs interaktion bland tre antibiotika i två exemplar i fem dagar, med hjälp av endast tre 96 brunnar mikroplattor och vanlig laboratorieutrustning. Vi presenterar representativa resultat visar att tre-antibiotikum kombinationen av Levofloxacin + Nalidixic syra + Penicillin G är synergistiska. Våra protokoll skalas upp för att mäta interaktioner bland många droger och andra biologiska sammanhang, vilket möjliggör effektiv skärmar för flera läkemedel synergier mot patogener och tumörer.

Tidigare, vi har rapporterat de parvisa interaktioner bland tre läkemedel: LEV, NAL och PNG baserat på tester i miniatyriserade schackrutiga analyser, där två droger kombinerades i en 4 x 4-matris13,14. NAL och LEV var synergistisk, rapporterades PNG vara antagonistiska med både LEV och NAL13,14. Här, vi verifierat dessa parvisa interaktioner och mätt trevägs interaktionen mellan dessa tre läkemedel med en diagonal-analys. Våra resultat visar att LEV + NAL + PNG är en synergistisk 3-vägs antibiotisk kombination. Schematiska för resultaten av avsnitten enskilda experimentella förfarandet gavs på höger sida av figur 7 och figur 8. Här presenterar vi och tolka representativa raw resultat från tre plattan behandlingar, som ges i figur 9. Den övre platta behandlingen motsvarar seriell och linjära utspädning experiment utfördes i steg 2 och 3. De nedre två platta behandlingarna är dubblerade interaktion plattor genomfördes i steg 4.
Raw-data i figur 9 visar att top tillväxt är runt 0,55, men det finns en 0,05 optiska densitet media själv, som observerats i OD600 av de höga läkemedelskoncentrationen där det finns någon tillväxt. Därför definierar vi IC50 som (0.55-0.05)/2 = 0,25. För varje dos-respons visas brunnarna ligger närmast värdet med orange.
Den övre halvan av figur 9A visar resultatet från steg 2, seriell dos-respons experiment. IC50 brunnarna för LEV är i kolumn 10 i två replikat, som motsvarar 4 ng/mL. IC50 för NAL och PNG är vid 3 µg/mL och 25 µg/mL, respektive. Dessa koncentrationer motsvarar 1 x koncentrationen visas i figur 7B. Den nedre halvan av figur 9B visar resultatet från steg 3, linjärt dos-respons experiment. LEV, NAL och PNG'S IC50 finns på 0,4, x 0,8 och 1,2 x, respektive. Dessa koncentrationer är tilldelade som 1 X IC50 för steg 4.
Två plattor motsvarande två replikat experiment visas i figur 9B, där IC50 brunnar visas med orange. I plattan 1 har alla enda läkemedel sin IC50 vid koncentration av 1 x. Förväntade IC50 för kombinationen parvisa eller trevägs beräknas av det aritmetiska medelvärdet av konstituerande droger, att göra förväntade IC50 för alla kombinationer också 1 x koncentration. I plattan 2, LEV och PNG har deras IC50 1 x koncentration, men NAL IC50 är på 1,2 x. Förväntade IC50 för varje kombination definieras med hjälp av det arithmetic hjälpmedlet av dessa IC50-värden. Till exempel beräknade IC50 för LEV + NAL och NAL + PNG är 1,1 x. Läkemedelsinteraktion Poäng (FIC) för varje kombination beräknas genom att dividera observerade IC50 med förväntade IC50, som visas på höger sida av plattorna. Inspektion av FIC partitur av två skyltar visar att LEV + NAL och LEV + NAL + PNG synergistisk, medan LEV + PNG och NAL + PNG är antagonistisk. FIC scores erhållna i de två plattorna är överens, stödja tillförlitligheten i protokollet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figur 1: Null modell definition för Loewe additivitet drog interaktionsmodell. Två 5 x 5 matriser på en mikroplattan, där drog A ökas linjärt i en axel som visas till vänster och en högsta koncentration av läkemedlet hämmar en kvantifierbar fenotyp (överst till höger). Tillägg av dessa matriser visas i mitten, där raderna ansluta ekvipotenta läkemedel en koncentrationer i varje enda läkemedel har samma koncentration som drog A. När celler läggs på denna ”schackbräde” av läkemedelskombinationer koncentration, förväntas det att motsvarande för brunnarna ansluts den inspelade fenotypen på denna linje. I detta self-själv drog interaktion experiment förväntas den isobole föreställande en fenotyp (visas med en streckad grön linje) vara linjär, definiera additivitet null modell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figur 2: parvisa läkemedelsinteraktioner enligt Loewe additivitet drog interaktionsmodell. När två läkemedel kombineras i en schackrutiga analysen enligt figur 1, kan observerade isophenotypic konturen vara rak, konvex eller konkav. Till höger är möjligt isophenotypic konturer (streckad grön linje) ovanpå schackrutiga analyser. Läkemedelskombinationer med raka isophenotypic konturer är Loewe-tillsats, som konturer inte skiljer sig från en self-self drogpåverkan, som är Loewe-tillsats per definition. När isophenotypic konturen är betydligt konkav eller konvex, är kombinationen synergistiska eller antagonistiska, respektive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figur 3: tre-vägs läkemedelsinteraktioner enligt Loewe additivitet drog interaktionsmodell. Liknar schackrutiga analysen för parvisa interaktioner, tre-droger kombineras i en 3D grid (en ”checkercube”), där varje läkemedel ökas linjärt i en axel. Om de tre drogerna var identiska, är isophenotypic ytan väntat till vara platt, definiera additivitet för tre läkemedelskombinationer. Om ytan är mer konkav eller konvex än denna Loewe-tillsatsen null modell, är läkemedelskombinationer synergistiska eller antagonistiska, respektive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figur 4: Diagonal metod att mäta parvisa läkemedelsinteraktioner. För varje schackrutiga assay mäts endast de regioner som visas i magenta rektanglar. i och ii ökar linjärt enda läkemedelskoncentrationen. III bedöms genom att göra en 1:1 blandning av två mediciner och linjärt titreringen denna blandning som om det var en enda drog. FIC är lika observerade IC50 i kombinationen dividerat med den förväntade IC50 av två enda läkemedel. För Loewe additivitet modellen approximeras förväntade IC50 av genomsnittligt IC50 av de två enda läkemedel. Ett FIC värde är 1 för Loewe-tillsatsen par och är lägre eller högre än 1 för synergistiska eller antagonistiska par, respektive2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figur 5: Diagonal metod att mäta trevägs läkemedelsinteraktioner. För varje checkercube assay mäts endast de regioner som visas. i, ii och iii ökar linjärt enda läkemedelskoncentrationen. IV mäts genom att göra en 1:1:1 blandning av tre läkemedel och linjärt titreringen denna blandning som om det vore en enda drog. Fraktionerad hämmande koncentration är lika med den observerade IC50 i kombinationen dividerat med den förväntade IC50 får tre enda läkemedel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figur 6: arbetsflöde för protokollet diagonal metod beskrivs häri och setup detaljerna för varje mikroplattan. Plattan visas i dag 4 bedrivs i två exemplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figur 7: Serial och linjära utspädning dos-respons experiment. (A) beredning av seriell utspädning dos-respons för en drog och motsvarande slutliga läkemedelskoncentrationen. E. coli celler läggs till plåten; tillväxt registreras efter 16 h. seriell IC50, visas i orange, väljs för varje läkemedel för användning i följande dag s linjär utspädning dos-respons experiment. (B) beredning av linjära utspädning dos-respons för en drog och motsvarande slutliga läkemedelskoncentrationen. E. coli celler läggs till plåten; tillväxt registreras efter 16 h. För varje drog drog de valda IC50s som kommer att användas i följande dagens interaktion experiment visas i orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figur 8: Drug interaktion experiment. Beredning av interaktion experiment är liknar enda drogen linjärt dos-svar, förutom att en 1:1 eller 1:1:1 blandning av droger används för två eller tre läkemedel dos-respons, respektive. Observerade IC50s för varje dos-respons, skildras i orange, används för att beräkna FIC poäng. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figur 9: representant experimentera resultat. Representativa resultat som erhållits med protokollet beskrivs visas, med detaljer i huvudtexten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonal metod för att mäta synergi mellan valfritt antal droger

I detta protokoll beskriver vi hur man gör Loewe additivitet-baserade läkemedlet interaktion mätningar för pairwise och trevägs läkemedelskombinationer.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

This method can help answer key questions in systems biology such as how combinations of multiple drugs or agents affect shorten The main advantage of this technique is that its efficiency and ease of interpretability allows the study of interactions between more than two agents. Begin this procedure with preparation of antibiotic aliquots and the bacterial culture as detailed in the text protocol. Take one aliquot of each drug from minus 20 degrees Celsius and leave the aliquots to thaw at room temperature for 10 minutes.To prepare for serial dilutions of these drugs, mix 990 microliters of LB media, and 110 microliters of DMSO to make LB 10%sol. Then, prepare 500 microliters of LB 10%LEV by mixing 450 microliters of LB media and 50 microliters of LEV. Vortex the LB 10%sol for five seconds at the highest setting.Add 20 micro liters of LB 10%sol to the top four rows of the wells in the 96-well micro plate. Now, vortex the LB 10%LEV in the same way. Add 20 microliters of LB 10%LEV to the first well in row A.Next, prepare a twofold serial dilution for LB 10%LEV by aspirating 20 microliters from the first well, adding it to the second well, and pipetting up and down five times.Repeat this for all wells sequentially until the 11th well which ends up with 40 microliters. Remove and discard 20 microliters of the content from the 11th well using a micro pipette. Repeat these steps for NAL using the second row of the micro plate.And for PNG using the third row. Then, repeat these steps for the drug LEV again on the fourth row as an internal positive control. Using a spectrophotometer, measure the optical density at 600 nanometers or OD600 of a one to 10 dilution of the culture.Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01. Then, pour the diluted cells into a reservoir. Using a multichannel micro pipette, add 80 microliters of the diluted cells to the drug serial dilutions.Seal the plate to prevent evaporation. Incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius. Then, start a new bacterial culture to use for the dose-response experiment.Measure the OD600 for the serial dilution dose-response plate using a plate reader and normalize the growth as described in the text protocol. For each drug, locate the wells that have approximately 50%growth inhibition or IC50. Assign the concentration in these wells as serial IC50 for each drug.Next, thaw fresh drug aliquots. Prepare one milliliter of LB 10%drug by mixing LB media and drug in a nine to one ratio. Here, the drug's concentration is 100 times each drug serial IC50, before adding the LB media.Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Also, prepare one milliliter of LB 10%sol as before. Prepare a linearly increasing doses of LEV, NAL, and PNG in 11 concentrations by mixing LB 10%drug and LB 10%sol in volumes as shown here.Also, prepare linearly increasing doses of LEV on fourth row as an internal positive control. Now, measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture that has been growing. Dilute the cells in five milliliters of LB media to an OD600 of 0.01.And pour the diluted culture into a reservoir. Add 80 microliters of the diluted cells to the drug linear dilutions using a multichannel micro pipette. Then, incubate the plate for 16 hours at 37 degrees Celsius.Also, start two fresh bacterial cultures for the interaction experiment. Measure the OD600 for the linear dilution dose-response. For each drug, choose the concentration that resulted in IC50 and prepare the drug in 100 times IC50 concentrations.Next, use freshly thawed drugs to prepare 100 times IC50 for each drug. From these, formulate one to one drug mixtures by volume of LEV plus NAL, LEV plus PNG, and NAL plus PNG. Also, prepare a one to one to one drug mixture of LEV plus NAL plus PNG.Now, prepare two plates for drug interaction experiments, similar to before, except that a one to one or one to one to one mixture of drugs is used. Measure the OD600 of the one to 10 dilution of the culture started earlier. Prepare two dilutions with an OD600 of 0.01 in five milliliters of LB media.Add 80 microliters of the cells from culture one onto plate one and add 80 microliters of the cells from culture two onto plate two. After sealing the plates to prevent evaporation, incubate them for 16 hours at 37 degrees Celsius. Following incubation, measure the OD600 absorbance for the diagonal drug interaction experiment plates.For each row, locate the column that has growth inhibition closest to the IC50. Assign the IC50 based on the relative concentration of drug in this well. Shown here is one plate of a duplicate drug interaction experiment.All single drugs have their IC50 which is defined as an absorbance of 0.25 at one times concentration. The expected IC50 for the pairwise or three way combination is calculated by the arithmetic mean of constituent drugs making the expected IC50 for all combinations also one times concentration. The drug interaction score or FIC for each combination is calculated by dividing the observed IC50 by the expected IC50.Inspection of the FIC scores demonstrates that LEV plus NAL, and LEV plus NAL plus PNG are synergistic, while LEV plus PNG, and NAL plus PNG are antagonistic. The FIC scores obtained from the second duplicate plate are in agreement, supporting the reliability of the protocol. Generally, individuals new to this method will struggle because reproduce all the results will require minute attention to detail and day to day consistency.While attempting this procedure, it's important to remember to be extremely careful with drug and cell concentrations to ensure reproducible dose-response relationships. Although the method presented here is optimized for bacteria, it can also be applied to other biological systems such as mammalians cell lines. The implications of this technique extend towards therapy of infectious diseases or cancer, because these diseases often require treatment by multiple drugs.After its development, this technique paved the way for researchers to explore synergies among many agents in tuberculosis and colorectal cancer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Ett beteende analys för att mäta lyhördhet Zebrafish till förändringar i ljusintensiteter

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Injektionsstället och Hemolymph Extraction till Mät insulinkänsligheten hos vuxna Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array jämförande genomik hybridisering (Array CGH) för detektion av genomiska Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kvantitativ Immunofluorescens analys för att mäta variationen i proteinnivåer vid Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Använda plusTipTracker Programvara för att mäta mikrotubuli Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tillväxt Kottar

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro-analys för att mäta Fosfatidyletanolamin Methyltransferase aktivitet

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Högupplösta respiration att mäta mitokondriefunktion av intakt betacellerna i närvaro av naturliga föreningar

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...