Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Wij danken Jenny-Lee Thomassin voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door de ANR verleent MITOPATHO en PATHIMMUN, verleent de Labex Memolife en PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun is een ontvanger van een subsidie van de Ph.D. van de China Scholarship Raad. Laurent Combettes en Guy Tran Van Nhieu zijn ontvangers van een beurs van WBI-France Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. voorbereiding
<ol><li>
Voorbereiding van de bacteriën
	<ol>
<li>Plaat van de bacteriën —Shigella wild-type stam uiting geven aan de AfaE adhesine (M90T-AfaE) — op een trypticase (TCS) soja agar plaat met 0,01% Congo rood (CR) en hen Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C. Opmerking: Het vergroten van hun reproduceerbaarheid, de Shigella platen verkregen in stap 1.1.1 bij 4 ° C worden opgeslagen en moeten worden gebruikt binnen een week, omdat alle kolonies op de drager van...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Dit manuscript wordt het protocol dat we ontworpen om te volgen van lokale Ca2 + signalen tijdens de relatief korte kinetiek van een Shigella -invasie, evenals global Ca2 + reacties tijdens de uitgebreide kinetiek van Shigellabeschreven. Hieronder signalen kwesties kunnen worden gevonden die moeten worden aangepakt om het optimaliseren van de opsporing van Ca2 + toets terwijl het minimaliseren van elke bemoeienis met de biologische processen.
Che...

CA2 + regelt alle bekende cel procédés, met inbegrip van cel dood trajecten aan gastheer-pathogeen interacties1,2,3gerelateerde cytoskeletal reorganisatie en inflammatoire reacties. Onder fysiologische omstandigheden, basale cytosolische Ca2 + concentraties zijn laag, in de honderden nM-bereik, maar kunnen worden onderworpen aan tijdelijke verhogingen op agonist stimulatie. Deze variaties tonen vaak oscillerende gedrag door het optreden van pompen en kanalen in het plasma en endoplasmatisch reticulum membranen. Het patroon van deze oscillaties wordt gekenmerkt door de periode, duur en amplitude van Ca2 + toeneemt, en wordt gedecodeerd door cellen die, op zijn beurt leiden specifieke reacties tot in wat bekend als de Ca2 + code4,5 staat . Een aanhoudende stijging van de cytosolische Ca2 + concentratie onder pathologische omstandigheden kan leiden tot de dood van de cel die is gekoppeld aan de permeabilization van de mitochondriale membraan en de vrijlating van de pro-apoptotic of necrotische factoren6, 7.
Shigella, de verwekker van bacillaire dysenterie, binnenvalt epitheliale cellen door het injecteren van effectoren in cellen van de gastheer met een type III secretie systeem (T3SS)8,9. Een Shigella -invasie van cellen van de gastheer wordt geassocieerd met lokaal en mondiaal Ca2 + signalen ontlokte door de T3SS. Wat betreft de porie-vormende toxinen, de T3SS translocon dat wordt ingevoegd in de celmembranen van de gastheer en is vereist voor de injectie van T3SS effectoren waarschijnlijk is verantwoordelijk voor de activering van PLC en de inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhankelijke Ca2 + release. De combinatie van de gelokaliseerde PLC stimulatie en de accumulatie van gepolymeriseerde actine bij plaatsen van een Shigella invasie resultaat in een opslagruimte langdurige InsP3-afhankelijke Ca2 + release10. Het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4,5 difosfaat (PIP2) -4-fosfatase, beperkt de lokale hoeveelheid PIP2, waardoor de controle van de hoeveelheid beschikbaar materiaal voor PLC voor het genereren van InsP3, die aan de opsluiting van lokale Ca2 bijdraagt + Reacties op11,12van de sites van de bacteriële invasie. Deze lokale Ca2 + reacties waarschijnlijk bijdragen tot de actine polymerisatie op Shigella invasie sites10. Global Ca2 + antwoorden die ook door Shigella, echter ontlokte zijn zijn overbodig voor de invasie van bacteriën proces maar leiden tot de opening van connexin hemichannels op het plasma-membraan en de vrijlating van ATP in de extracellulaire compartiment. Vrijgegeven ATP handelen op een wijze van paracrine, op zijn beurt, stimuleert Ca2 + oscillerende reacties in de cellen naast de geïnfecteerde cel. IpgD is ook verantwoordelijk voor het vormgeven van globale Ca2 + reacties in grillige geïsoleerde reacties met langzame dynamiek. Uiteindelijk, na een langdurige bacteriële infectie leidt IpgD tot de remming van InsP3-gemedieerde Ca2 + signalen. Via haar bemoeienis met Ca2 + signalering, IpgD vertragingen een Ca2 +-afhankelijke calpain activering leidt tot de demontage van focal hechting structuren en de voortijdige detachement van geïnfecteerde cellen13.
Terwijl Ca2 + signalen bij kritieke aspecten van pathogenese betrokken zijn, verhoogt het gebruik van een micro-organisme een aantal technische uitdagingen die niet in klassieke agonist studies voordoen zich. De protocollen beschreven hier gebruik maken van de gebruikte TL Ca2 + chemische indicator Fluo-4 die we ontworpen om te karakteriseren van lokale Ca2 + signalen tijdens een Shigella -infectie. Stappen van cruciaal belang voor het opsporen van deze signalen worden besproken, evenals procedures voor hun kwantitatieve analyse die vereist is voor het karakteriseren van de rol van bacteriële effectoren in Ca2 + signalering geïmplementeerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

CA2 + is een alomtegenwoordige ion bij alle bekende cellulaire processen betrokken zijn. Terwijl de globale Ca2 + reacties kunnen invloed hebben op het lot van de cel, reguleren lokale variaties in gratis Ca2 + cytosolische concentraties, gekoppeld aan het bevrijden van interne winkels of een toestroom via plasmamembraan kanalen, corticale cel processen. Ziekteverwekkers die voldoen aan anders binnenvallen gastheer cellen trigger een reorganisatie van het cytoskelet van de actine ten grondslag liggen aan de host plasmamembraan, die waarschijnlijk van invloed op zowel lokale als globale Ca2 + signalering. Omdat deze gebeurtenissen bij lage frequenties in een pseudo-stochastische wijze over uitgebreide kinetiek voordoen, verhoogt de analyse van Ca2 + signalen veroorzaakt door pathogenen grote technische uitdagingen die moeten worden aangepakt.
Wij rapporteren hier protocollen voor de detectie van globale en lokale Ca2 + signalen op een Shigella besmetting van epitheliale cellen. In deze protocollen, artefacten gekoppeld aan een langdurige blootstelling en photodamage geassocieerd met de excitatie van Ca2 + fluorescerende sondes zijn daarvoor door strikt de overname parameters controle over bepaalde perioden tijdens een Shigella invasie. Procedures om te analyseren rigoureus de amplitude en frequentie van globale cytosolische Ca2 + signalen tijdens uitgebreide infectie kinetiek met behulp van de chemische sonde Fluo-4 ten uitvoer worden gelegd.

Shigella invasie wordt geassocieerd met atypische langdurige lokale Ca2 + antwoorden:
Naar aanleiding van het bovengenoemde protocol, Fluo-4-loaded HeLa cellen werden uitgedaagd met WT Shigella en stream acquisities werden uitgevoerd om te analyseren van Ca2 + signalen. Een representatieve experiment is afgebeeld in Figuur 1, met time-lapse beelden serie van de i...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca2 +) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca2 + fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca2 + signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.

Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...