Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
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Wir danken für ihre Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts Jenny-Lee Thomassin. Die Arbeit wurde unterstützt durch die ANR gewährt, MITOPATHO und PATHIMMUN, aus dem Labex Memolife und PSL IDEX Shigaforce gewährt. Chunhui Sonne ist ein Empfänger Ph.d. von der China Scholarship Council. Laurent Combettes und Guy Tran Van Nhieu sind Empfänger von einem WBI-Frankreich-Austausch Tournesol Programm N ° 31268YG (Wallonie-Brüssel International, Fonds De La Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires Étrangères et Européennes, Ministère de nannte Supérieur et De La Recherche Dans le Cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bakterien-Vorbereitung
	<ol>
<li>Platte die Bakterien –Shigella Wildtyp Stamm mit dem Ausdruck der AfaE adhäsin (M90T-AfaE) – auf einem Trypticase Soja (TCS) Agar Platte mit 0,01 % Kongo-rot (CR) und inkubieren sie 18 h bei 37 ° C. Hinweis: Um ihre Reproduzierbarkeit zu erhöhen, die Shigella -Platten in Schritt 1.1.1 erhaltenen bei 4 ° C gelagert werden und sollte innerhalb einer Woche verwendet werden, da alle Kolonien auf CR-Medium im Laufe der ...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll, das wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während der relativ kurzen Kinetik einer Shigella -Invasion, sowie globale Ca2 + Antworten während der erweiterten Kinetik von Shigellazu folgen. Im folgenden Signale Schlüssel finden Sie Themen, die angesprochen werden, um die Erkennung von Ca2 + optimieren müssen bei gleichzeitiger Minimierung der Interferenzen mit der biologischen Prozesse.
Chemischen <...

Ca2 + regelt alle bekannten Zellprozesse, einschließlich Zellskelett Reorganisation, Entzündungsreaktionen und Zelle Tod Wege im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen Interaktionen1,2,3. Unter physiologischen Bedingungen basale cytosolische Ca2 + Konzentrationen sind niedrig, in den Hunderten von nM-Bereich, aber können zu einem vorübergehenden Anstieg nach Agonist Stimulation unterzogen werden. Diese Variationen zeigen oft oszillierende Verhalten durch das Wirken von Pumpen und Kanäle im Plasma und endoplasmatische Retikulum Membranen. Das Muster dieser Schwingungen zeichnet sich durch die Zeit, Dauer und Amplitude der Ca2 + erhöht und wird durch Zellen, die wiederum bestimmte Reaktionen lösen in, was als Ca2 + Code4,5 bekannt entschlüsselt . Eine nachhaltige Steigerung der cytosolischen Ca2 + Konzentration unter pathologischen Bedingungen führen zum Zelltod führt die Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Pro-apoptotische oder nekrotischen Faktoren6zugeordnet, 7.
Shigella, dem Erreger der bazillendysenterie, dringt Epithelzellen durch Einspritzen von Effektoren in Wirtszellen mit einem Typ III-Sekretion System (T3SS)8,9. Eine Shigella -Invasion von Wirtszellen ist verbunden mit lokalen und globalen Ca2 + Signale ausgelöst durch die T3SS. Für Pore bilden Giftstoffe, die T3SS-Translocon, die fügt in Host Zellmembranen und ist erforderlich für die Injektion von T3SS Effektoren wahrscheinlich ist verantwortlich für die Aktivierung der SPS und der Inosit (1, 4, 5)-Trisphosphate (InsP3)-abhängige Ca2 + lassen Sie los. Die Kombination aus der lokalisierten PLC-Stimulation und die Anhäufung von polymerisierten Aktin an Standorten eines Shigella Invasion führen eine untypisch lang andauernde InsP3-abhängige Ca2 + release10. Der Typ-III-Effektor IpgD, ein Phosphatidyl 4,5-Bisphosphate (PIP2)-4-Phosphatase, beschränkt die lokalen PIP2, wodurch die Steuerung der Menge der verfügbaren Substrat für SPS, InsP3, generieren, die an die enge des lokalen Ca2 + trägt Antworten bei bakteriellen Invasion Seiten11,12. Diese lokalen Ca2 + Antworten wahrscheinlich dazu beitragen, die Aktin-Polymerisation bei Shigella Invasion Websites10. Globalen Ca2 + Antworten, die jedoch auch durch Shigella, ausgelöst werden sind entbehrlich für die bakterielle Invasion Prozess aber auslösen, die Öffnung der Connexin-Hemichannels an der Plasmamembran und die Freisetzung von ATP in der extrazellulären Fach. Freigesetzte ATP Parakrine handeln, stimuliert wiederum Ca2 + oszillierende Reaktionen in den Zellen neben der infizierten Zelle. IpgD ist auch verantwortlich für die Gestaltung der globalen Ca2 + Antworten zu unberechenbar isolierten Reaktionen mit langsamen Dynamik. IpgD führt schließlich, nach einer längeren bakterielle Infektion auf die Hemmung der InsP3-vermittelten Ca2 + Signale. Durch seine Einmischung mit Ca2 + Signalisierung IpgD verzögert eine Ca2 +-abhängigen Calpain Aktivierung führt zu die Demontage der fokale Adhäsion Strukturen und die vorzeitige Ablösung von infizierten Zellen13.
Während Ca2 + Signale wichtige Aspekte der Pathogenese beteiligt sind, wirft die Verwendung eines Mikroorganismus eine Reihe von technischen Herausforderungen, die nicht im klassischen Agonist Studien anzutreffen sind. Die Protokolle beschrieben verwenden Sie hier die häufigsten verwendeten fluoreszierenden Ca2 + chemischen Indikator Fluo-4, die wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während einer Shigella Infektion zu charakterisieren. Schritte für die Erkennung dieser Signale werden erläutert, sowie Verfahren für die Quantitative Analyse, die erforderlich sind, um die Rolle der bakteriellen Effektoren in Ca2 + Signalisierung zu charakterisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

Ca2 + ist eine allgegenwärtige Ion alle bekannten zellulären Prozessen beteiligt. Während globale Ca2 + Antworten Zelle Schicksal beeinträchtigen können, Regeln lokale Variationen in frei Ca2 + cytosolischen Konzentrationen, verbunden zum lösen vom internen Speicher oder einen Zustrom durch Plasmamembran Kanäle, kortikale Zellprozesse. Krankheitserreger, die an oder dringen Host Zellen Trigger eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts zugrunde liegenden Host Plasmamembran, die wahrscheinlich sowohl auf globaler als auch auf lokalen Ca2 + Signalisierung betrifft. Da diese Ereignisse bei niedrigen Frequenzen in einer Pseudo-stochastische Weise über erweiterte Kinetik auftreten können, wirft die Analyse von Ca2 + Signale durch Krankheitserreger verursacht große technischen Herausforderungen, die angegangen werden müssen.
Hier berichten wir Protokolle zum Nachweis von globalen und lokalen Ca2 + Signale auf eine Shigella Infektion der Epithelzellen. In diesen Protokollen Artefakten verknüpft zu einer längeren Exposition und lichtbedingten verbunden mit der Anregung von Ca2 + fluoreszierende Sonden sind streng kontrollieren die Aufnahmeparameter über definierte Zeiträume während einer Fehlerbehebung Shigella Invasion. Verfahren werden implementiert, um konsequent die Amplitude und Frequenz der globalen cytosolischen Ca2 + Signale analysieren während der ausgedehnten Infektion Kinetik mit der chemischen Sonde Fluo-4.

Shigella Invasion ist atypisch lang anhaltende lokale Ca2 + Antworten zugeordnet:
Nach dem oben genannten Protokoll Fluo-4 geladen HeLa-Zellen wurden mit WT Shigella herausgefordert und Stream Akquisitionen wurden durchgeführt, um Ca2 + Signale analysieren. Abbildung 1zeigt eine repräsentative Experiment mit Zeitraffer-Bilder-Serie von der Fluoreszenzintensitä...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca2 +) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca2 + fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca2 + Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

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Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

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Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

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Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

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Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

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A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...