Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
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원고 편집에 그녀의 도움에 감사 제니 리 Thomassin 하 고. 작품은 ANR에 의해 지원 되었다 MITOPATHO 및 PATHIMMUN를 부여, PSL IDEX Shigaforce Labex Memolife를 부여. Chunhui 태양은 중국 장학금 위원회에서 박사 그랜트의 받는 사람입니다. 로 랑 Combettes와가 트 란 반 Nhieu는 WBI 프랑스 exchange Tournesol 프로그램 N ° 31268YG의 받는 사람 (Wallonie Bruxelles 국제, Fonds 드 라 검색 과학, Ministère 프랑스어 데 레 아 페르 étrangères 등등 européennes, Ministère 데 l'Enseignement supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche dans le 간부 des Partenariats 휴버트 Curien).

1입니다. 준비
<ol><li>
박테리아 준비
	<ol>
<li>박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어 참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문?...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca2 + 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca2 + 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아2 + 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.
화학 대 유전자에 캘?...

캘리포니아2 + cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아2 + 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca2 + 코드4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독 . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인6,의 출시와 관련 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 7.
이질균, 세균성이 질의 원인이 되는 에이전트 유형 III 분 비 체계 (T3SS)8,9를 사용 하 여 호스트 셀에 이펙터를 주입 하 여 상피 세포를 침입 한다. Shigella 침공 호스트 세포의 지역 및 글로벌 Ca2 + 신호는 T3SS에 의해 elicited와 연결 됩니다. 기 공 형성에 관해서는 독 소, 호스트 세포 막에 삽입 하 고이 필요 T3SS 이펙터의 주입은 T3SS translocon PLC 및 이노 시 톨 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)의 활성화에 대 한 책임-종속 Ca2 + 릴리즈입니다. 지역화 된 PLC 자극과 생산 말라는 예외적인 오랫동안 InsP3 종속 Ca2 + Shigella 침공 결과의 사이트에서의 축적의 조합10을릴리스 합니다. 유형 III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2)-4-인산 가수분해 효소, 제한 지역 PIP2, 로컬 Ca2 + 의 감 금에 기여 하는 InsP3를 생성 하는 PLC에 대 한 사용 가능한 기판의 수량을 제어 함으로써 세균성 내 습 사이트11,12에 응답 합니다. 이러한 로컬 Ca2 + 응답 가능성이 Shigella 침공 사이트10걸 중 합에 기여 한다. 그러나 이질균에 의해, elicited 또한 글로벌 캘리포니아2 + 응답 세균성 내 습 프로세스에 불가결 하지만 플라즈마 막에서 connexin hemichannels의 열고는 세포 외에서 ATP의 릴리스 트리거 구획입니다. 출시 된 ATP paracrine 방식으로 행동, 캘리포니아2 + 진동 응답 감염된 셀 옆 셀에 자극. IpgD 글로벌 Ca2 + 응답을 형성 하는 느린 역학과 엉뚱한 고립 된 응답에 대 한 책임 이기도 합니다. 결국, 장기간된 세균 감염 시 IpgD InsP3 중재 Ca2 + 신호 억제에 지도 한다. 캘리포니아2 + 신호는 간섭를 통해 IpgD 지연 캘리포니아2 +-종속 calpain 활성화 초점 접착 구조의 해체와 조기 분리로 이어지는 셀13감염.
캘리포니아2 + 신호 병의 중요 한 측면에 관련 된, 하는 동안 미생물의 사용 다양을 한 클래식 주 작동 근 연구에서 발생 하지 않는 기술적인 문제를 발생 시킵니다. 프로토콜 설명 여기는 일반적으로 사용 되 형광 캘리포니아2 + 화학 표시기 Fluo-4 우리 Shigella 감염 시 로컬 Ca2 + 신호 특성 설계를 사용 합니다. 이러한 신호 검출을 위한 중요 한 단계는 캘리포니아2 + 신호에 세균성 이펙터의 역할을 특성화 하는 데 필요한 그들의 정량 분석에 대 한 구현 절차 뿐만 아니라 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

캘리포니아2 + 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca2 + 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아2 + cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.
여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아2 + 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아2 + 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.

Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca2 + 응답:
위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca2 + 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 ...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

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복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...