Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
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원고 편집에 그녀의 도움에 감사 제니 리 Thomassin 하 고. 작품은 ANR에 의해 지원 되었다 MITOPATHO 및 PATHIMMUN를 부여, PSL IDEX Shigaforce Labex Memolife를 부여. Chunhui 태양은 중국 장학금 위원회에서 박사 그랜트의 받는 사람입니다. 로 랑 Combettes와가 트 란 반 Nhieu는 WBI 프랑스 exchange Tournesol 프로그램 N ° 31268YG의 받는 사람 (Wallonie Bruxelles 국제, Fonds 드 라 검색 과학, Ministère 프랑스어 데 레 아 페르 étrangères 등등 européennes, Ministère 데 l'Enseignement supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche dans le 간부 des Partenariats 휴버트 Curien).

1입니다. 준비
<ol><li>
박테리아 준비
	<ol>
<li>박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어 참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문?...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca2 + 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca2 + 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아2 + 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.
화학 대 유전자에 캘?...

캘리포니아2 + cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아2 + 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca2 + 코드4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독 . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인6,의 출시와 관련 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 7.
이질균, 세균성이 질의 원인이 되는 에이전트 유형 III 분 비 체계 (T3SS)8,9를 사용 하 여 호스트 셀에 이펙터를 주입 하 여 상피 세포를 침입 한다. Shigella 침공 호스트 세포의 지역 및 글로벌 Ca2 + 신호는 T3SS에 의해 elicited와 연결 됩니다. 기 공 형성에 관해서는 독 소, 호스트 세포 막에 삽입 하 고이 필요 T3SS 이펙터의 주입은 T3SS translocon PLC 및 이노 시 톨 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)의 활성화에 대 한 책임-종속 Ca2 + 릴리즈입니다. 지역화 된 PLC 자극과 생산 말라는 예외적인 오랫동안 InsP3 종속 Ca2 + Shigella 침공 결과의 사이트에서의 축적의 조합10을릴리스 합니다. 유형 III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2)-4-인산 가수분해 효소, 제한 지역 PIP2, 로컬 Ca2 + 의 감 금에 기여 하는 InsP3를 생성 하는 PLC에 대 한 사용 가능한 기판의 수량을 제어 함으로써 세균성 내 습 사이트11,12에 응답 합니다. 이러한 로컬 Ca2 + 응답 가능성이 Shigella 침공 사이트10걸 중 합에 기여 한다. 그러나 이질균에 의해, elicited 또한 글로벌 캘리포니아2 + 응답 세균성 내 습 프로세스에 불가결 하지만 플라즈마 막에서 connexin hemichannels의 열고는 세포 외에서 ATP의 릴리스 트리거 구획입니다. 출시 된 ATP paracrine 방식으로 행동, 캘리포니아2 + 진동 응답 감염된 셀 옆 셀에 자극. IpgD 글로벌 Ca2 + 응답을 형성 하는 느린 역학과 엉뚱한 고립 된 응답에 대 한 책임 이기도 합니다. 결국, 장기간된 세균 감염 시 IpgD InsP3 중재 Ca2 + 신호 억제에 지도 한다. 캘리포니아2 + 신호는 간섭를 통해 IpgD 지연 캘리포니아2 +-종속 calpain 활성화 초점 접착 구조의 해체와 조기 분리로 이어지는 셀13감염.
캘리포니아2 + 신호 병의 중요 한 측면에 관련 된, 하는 동안 미생물의 사용 다양을 한 클래식 주 작동 근 연구에서 발생 하지 않는 기술적인 문제를 발생 시킵니다. 프로토콜 설명 여기는 일반적으로 사용 되 형광 캘리포니아2 + 화학 표시기 Fluo-4 우리 Shigella 감염 시 로컬 Ca2 + 신호 특성 설계를 사용 합니다. 이러한 신호 검출을 위한 중요 한 단계는 캘리포니아2 + 신호에 세균성 이펙터의 역할을 특성화 하는 데 필요한 그들의 정량 분석에 대 한 구현 절차 뿐만 아니라 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

캘리포니아2 + 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca2 + 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아2 + cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.
여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아2 + 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아2 + 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.

Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca2 + 응답:
위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca2 + 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 ...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

The overall goal of this fluorescent microscopy analysis using chemical probes is to analyze local and global calcium responses elicited by host cells during infection by pathogenic Shigella. This method can help answer key questions in the field of cellular microbiology such as pathogen-induced signaling leading to cytoskeletal reorganization or cell death. The main advantage of this technique is that by using chemical probes one can follow local calcium signals associated with local processes diverted by the pathogen.Generally individuals new to this method will struggle because of the setting of parameters that enable to follow local calcium signals while preserving the integrity of biological samples. To begin, plate wild-type Shigella expressing the AfaE adhesion onto a trypticase soy or TCS agar plate containing 0.01%Congo red and incubate the plates at 37 degrees Celsius for 18 hours. Prepare pre-cultures from the streaked plates by picking three red colonies and inoculating TCS broth with 75 micrograms per milliliter of ampicillin.Grow the liquid cultures in a shaking incubator at 37 degrees Celsius and 200 rpm for 16 hours. Next, inoculate TCS with the bacterial pre-culture at a 1:100 dilution. Incubate the culture at 37 degrees Celsius in a shaking incubator at 200 rpm for two hours.Ensure that the optical density at 600 nanometers is 0.2 to 0.4. Centrifuge the culture at 13, 000 g and 21 degrees Celsius for two minutes and re-suspend the pellet in an equivalent volume of EM medium. Dilute the bacterial suspension in EM buffer at a final OD 600 of 0.1 and use it immediately or store it at 21 degrees Celsius and use it within the next 60 minutes.Grow HeLa cells in DMEM with one gram per liter of glucose supplemented with 10%FCS and grow the culture at 37 degrees Celsius with 10%CO2. Grow TC7 cells in DMEM with 4.5 grams per liter of glucose, 10%FCS, and non-essential amino acids and culture at 37 degrees Celsius and 10%CO2. For cell maintenance, split the cells regularly to avoid growth contact inhibition linked to confluent states.This is critical for high calcium probe loading and transfection efficiency. Trypsinize and count the TC7 cells. The day before the experiment with HeLa cells, plate the cells onto sterile, 25-millimeter diameter circular cover slips in six-well plates at a density of three times 10 to the five cells per well.Then, to allow for polarization before the experiments, seed the cells at four times 10 to the five cells per well and incubate them for five to seven days, replacing the medium every day. On the day of the experiment, remove the medium and use one milliliter of EM medium to wash the cells three times. Load the cells with three micromolar Fluo-4 AM and EM buffer and incubate the plates at 21 degrees Celsius for 30 minutes.With EM buffer, wash the samples three times, then add one milliliter of EM buffer, and incubate the cells at 21 degrees Celsius to allow for the hydrolysis of the AM moiety. Place the coverslip containing the Fluo-4 loaded cells in an imaging or glass-bottom chamber. Use EM buffer to wash the sample three times to remove compounds potentially resulting from cell lysis.Then, add one milliliter of EM buffer. Place the chamber on an inverted fluorescence microscope stage heated at 33 degrees Celsius. Select a microscopy field and set up acquisition parameters including exposure time and binning if necessary to optimize the Fluo-4 fluorescent signal.To add bacteria to the sample, carefully remove 500 microliters of EM buffer from the chamber and add 500 microliters of the bacterial suspension to obtain a final OD 600 of 0.05. Immediately perform an acquisition or wait 10 minutes to allow the bacteria to sediment onto the cells. At the end of the acquisition stream, acquire a phase-contrast image of the selected field to visualize the bacteria contacting the cells, and the membrane ruffles associated with bacterial invasion sites.Repeat the acquisition procedure at intervals that are amenable to the duration of the image acquisitions, file savings, and selection of a new field to cover the whole process. At the end of the acquisition procedure, add to the sample two micromolar of the calcium ionophore ionomycin to determine the maximal amplitude of the calcium signals. Acquire images every three to five seconds until the signal stabilizes, usually for less than 10 minutes.Follow by adding the calcium chelator EGTA to a final concentration of 10 millimolar to determine the fluorescent signal in the absence of calcium. Acquire images every three to five seconds until signal stabilization, usually for less than 10 minutes. Carry out image analysis according to the text protocol.In this experiment, Fluo-4 loaded HeLa cells were challenged with wild-type Shigella and stream acquisitions were performed to analyze calcium signals. A time-lapse image series of the fluorescence intensity of the Fluo-4 probe is averaged in a region of interest for a single cell, and the corresponding phase-contrast image is shown. Atypical local increases in free cytosolic calcium are observed at the Shigella invasion site with a varying amplitude and durations ranging from 2.5 to five seconds, followed by global increases in the infected cell.In this example, an isogenic mutant strain, deficient for the type III effector IpgD, a phosphatidyl 4, 5-bisphosphate phosphatase, induced more global and less atypical local responses with long durations as compared to the wild-type Shigella strain. As seen in this experiment, the imaging of global calcium responses over extended infection kinetics shows a decrease in the frequency of responses 30 minutes following the challenge with wild-type Shigella. Finally, the quantification of dose-dependent cell responses to the calcium agonist histamine illustrates the inhibition of an inositol triphosphate dependent calcium release at late stages of a Shigella infection.Following this procedure, all the methods simultaneously combining compatible fluids and imaging can be performed in order to address the role of calcium signals in a given process. Don't forget that working with pathogens can be extremely hazardous, and precautions such as waste disposal, cleaning of contaminated surfaces or equipments should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

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연구

면역학 및 감염병학

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