Name: bronchoalveolar lavage exosomes in lipopolysaccharide-induced septic lung injury
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury at JoVE.com

Авторы заявили никакого конфликта интересов.

Общий протокол требует 2 дней, включая первый день индукции сепсиса и изоляции бал жидкости из животного и на второй день для exosomes изоляции от мыши BALF. Все процедуры, рассмотрели и утвердили институциональный уход животных и использования Комитетом в медицинском центре Атланты ва.
<p cl...

<ol>
	<li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury.">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li><li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease:+potential+and+pitfalls.">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li><li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome:+from+mechanism+to+translation.">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , 855-860 (1950).</li><li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome:+A+Review+of+Analytical+Approaches,+Pathologic+Features,+and+Common+Measurements.">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li><li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Critical+Illness.">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li><li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li><li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+in+Lung+Disease.">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT:+STATE+OF+THE+ART.">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems,+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li><li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory:+a+therapeutic+opportunity?.">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?.</a> Diabetes, obesity &amp; metabolism. 18, 855-867 (2016).</li><li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease.">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li><li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea.">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li><li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues.">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li><li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection.">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li><li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages.">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , 5750-5761 (2015).</li><li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing.">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li><li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin.">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321 (2015).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241 (2014).</li><li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade.">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry &amp; high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine.">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li><li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice.">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide.">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li><li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators.">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li><li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy.">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , 221-232 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+(MDM)+and+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSC).">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li><li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li><li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection.">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li><li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma.">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma:+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods.">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686 (2015).</li><li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties.">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li></ol>

Модели мыши заболеваний широко используются для оценки физиологические функции конкретных генов и уменьшить стоимость экспериментов2. Септик ОПЛ описанных здесь имитирует воспалительной реакции, видел в людях с ОРДС. Эта модель имеет отношение к расследованию молекуляр?...

Али и ОРДС являются опасные для жизни формы дыхательной недостаточности с тяжелой гипоксемия, вызванные non кардиогенный отек легких, которая затрагивает около 1 миллиона человек во всем мире ежегодно1. Этиология ОРДС включает прямой травмы легких от инфекции или аспирации и целый ряд косвенных оскорбления. За последнее десятилетие наблюдается рост понимания молекулярный патогенез ОРДС, однако, конкретных целевых лечения ОРДС еще быть разработаны2,3.
Были разработаны несколько животных модели острого повреждения лёгких, которые обеспечивают мост для перевода экспериментальной терапии для человека исследования4,5. Часто используемые модели включают в себя местные установки олеиновой кислоты, бактерий, ПЛАСТИНОК и блеомицин. Другие подходы включают ишемии реперфузии, сенситизации лигирование прокол, механические ИВЛ индуцированное стрейч травмы, гипероксия или системного администрирования бактерий и LPS5. Эти модели обеспечивают полезные биологические системы для тестирования клинических гипотезы и для разработки потенциальных терапий. Чтобы имитировать человека ОРДС, Животные модели следует воспроизвести воспаления и острой травмы эпителиальных и эндотелиальных клеток с дефектами в барьерные функции в легких.
Exosomes мембрана везикулы с 20-200 Нм в диаметре, содержание которых молекулярный содержит белки, ДНК, РНК и липидов, и облегчить между сотовой связи в ткани микроокружения молекулярного состава переводом. Exosomes выделяется несколько типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, клетки эпителия, гладкомышечные клетки и клетки тумора и существуют в человеческий организм жидкости. Исследования показывают, что exosomes регулировать перекрестных помех между иммунные клетки и стромальных клеток при инфекционных и стерильные воспалительных заболеваний, и их аномальные релиз, как представляется, регулируются различные природные и экспериментальных стимулы при физиологических и6патологических процессов. Такие сети связи могут играть важную роль в патогенезе легочных заболеваний и может повлиять на патофизиологические прогрессирования7,8. Как 18-22 нуклеотидов некодирующих РНК, адаптивной существуют в ткани и жидкости организма, плазмы, сера и модулировать выражение mRNA в столб-поступательные уровня9,10.
Фасованные интерферирующим в exosomes влияние дифференциации и функции различных типов клеток, и чрезмерные уровни связаны с целым рядом заболеваний, включая рак, легочных заболеваний, ожирения, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний11, 12,13,14,,1516. Вступление в получателя клетки и челночные exosomal интерферирующим облегчить межклеточные связи, изменения гемостаза микроокружения17,18. Острого повреждения лёгких-это сложные процессы, с участием нескольких типов клеток с обширной межклеточных коммуникаций через exosomes8. Мир-155 и мир 146А общий механизм transcriptional регулирования и способствовать воспалительной реакции и Иммунологическая толерантность19,20. Недавние исследования показывают, что оба модуляции воспалительной реакции через exosomal интерферирующим челночные иммунные клетки21. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе модулирующее влияние exosomal интерферирующим на альвеолярной ответ эндотоксина остаются неясными, несомненно потенциальных клинической значимости и заслуг трансляционная последствия дальнейшего расследования.
Совместное культуры модели используются для определения взаимодействия типов конкретных клеток в сложных условиях, таких как воспаление и рак22,23. Эти платформы предоставляют альтернативную стратегию допросить кросс talk между типами клеток, особенно для иммунной и структурных клеток.
Внутри трахеи, аэрозольных, внутрибрюшинного или системного администрирования LPS широко используются для стимулирования экспериментальной легких повреждений24,25,26и показали, чтобы побудить проницаемость эпителия и эндотелиальных дефекты. Здесь мы используем внутрибрюшинного LPS побудить децентрализованная модель острого повреждения легких у мышей. В течение 24 h внутрибрюшинного администрации LPS проницаемость дефектов наведенные в легких с набора воспалительных клеток. Кроме того мы показывают, что exosomes от бал содержат Мирна-155 и мир 146А, и exosomes от жидкости бал побудить выражение провоспалительных цитокинов в получателей эпителиальных клеток, включая ИЛ-6 и ФНО α. Эти данные являются первым, чтобы показать, что exosomal интерферирующим выделяется в бал в этой модели септик ОПЛ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1276px;" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:691px;">lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">Escherichia coli 055:B5</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS pH7.2(1X)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mirVana miRNA isolation kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">449774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mmu-miR-155 (002571) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">has-miR-146a (000468) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U6snRNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF-&#945;(Mm00443258_m1 ) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IL-6 (Mm00446190_m1&#160;&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZO-1 (Mm00493699_m1&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">minimal essential medium (MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11095-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trysin-EDTA solution(0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome Spin Columns (MW3000)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4484449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L-100XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transmission electron microscopes (TEM)</td>
			<td>JEOL Ltd</td>
			<td>120 kV TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus BX41 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX41</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage exosomes in lipopolysaccharide-induced septic lung injury

ОПЛ (Али) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) представляют собой разнородную группу легочных заболеваний, который продолжает иметь высокие показатели заболеваемости и смертности. Молекулярный патогенез Али в настоящее время лучше определены; Однако ввиду сложного характера заболевания молекулярной терапии еще не разработаны. Здесь мы используем модель индуцированных мыши липополисахарида (LPS) септик ОПЛ разграничить роль exosomes в воспалительной реакции. С помощью этой модели, мы смогли показать, что мышей, которые подвергаются воздействию внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в бронхо альвеолярные промывание (BAL) жидкости из легких, которые упакованы с Мирна и цитокины, которые регулируют воспалительной реакции. Далее с помощью системы модель совместного культуры, мы показываем, что exosomes выпущена с макрофаги нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток. Эти результаты показывают, что 1) кросс talk между врожденной иммунной и структурных клетки через exosomal челночные способствовать воспалительной реакции и нарушения структурных барьеров и 2) ориентации этих адаптивной может предоставить новые платформы для лечения Али и ОРДС.

Чтобы побудить септик легких травм, мышей лечили внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК (15 мг/кг). В течение 24 ч LPS администрации нейтрофильные приток был замечен в легких, как показано на рисунке 1A. Было обращено мыши бал жидкости, следуют изоляция и очищение exosomes. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury at JoVE.com

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм

Мышей в внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в жидкости бронхо альвеолярные промывание (БАЖ), которые упакованы с адаптивной. С помощью системы совместного культуры, мы показывают, что exosomes, выпущенный в жидкости бал нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток и увеличить выражение провоспалительных цитокинов, что подчеркнет повреждения легких.

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

The overall goal of this experiment is to delineate the role of exosomes in the inflammatory responses in an LPS induced, acute septic lung injury mouse model. So this method can help answer key questions related to cell cross talk in acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. Especially intercellular communication within the alveolar-micro environment via exosome shuttling.The main advantage of this technique is that it allows the isolation and characterization of highly purified bronchoalveolar lavage exosomes derived from endotoxin treated septic mice with acute lung injury. Demonstrating the procedure is Dr.Zhihong Yuan and Dr.Chetna Bedi. To begin, load a one milliliter syringe equipped with a 27 gauge needle with 0.1 milliliters of LPS and PBS per mouse and manually restrain the first six to eight week old male C57 black 6J mouse.Deliver the LPS intra-peritoneally and return the animal to its cage. 24 hours later, make a five millimeter incision in the center of the neck of the first animal and use blunt forceps to gently separate the muscles to expose the trachea. Next, gently insert a 27 gauge needle attached to a sterile 10 milliliter syringe into the trachea and inject one milliliter of sterile PBS.Then immediately replace the 10 milliliter syringe with a three milliliter syringe equipped with a new 27 gauge needle. Aspirate the bronchoalveolar lavage fluid or BOLF and add the BOLF to an appropriately labeled 15 milliliter conical tube on ice. To isolate the exosomes, centrifuge the BOLF samples and transfer the supernatants to new 15 milliliter tubes.Centrifuge the samples again and transfer the supernatants to ultra-centrifuge tubes to remove the larger, cellular particles. Transfer the supernatants to new conical tubes and load the samples into 0.2 micron syringe filters to remove any remaining larger particles. Add the filtered samples to new ultra-centrifuge tubes to pellet the exosomes.Carefully discard the supernatants and re-suspend the pellets in 100 microliters of PBS per tube. Then transfer the exosome samples into individual 1.5 milliliter tubes for their minus 80 degree Celsius storage. To purify the exosomes, add 0.4 microliters of the appropriate exosome dye to one tube containing 100 microliters of suspension solution per sample and quickly add one thawed exosome sample to each tube of dye.Thoroughly mix the exosomes with the dye and incubate the samples at room temperature for five minutes, protected from light. At the end of the incubation, place one exosome spin column per sample into a 1.5 milliliter illusion tube and transfer the exosome solutions to the center of each spin column. Then centrifuge the samples, discard the columns, and store the alluded samples at minus 20 degrees Celsius.To measure exosome uptake by recipient cells, first seed one times 10 to the fourth mouse lung epithelial 12 cells in 0.5 milliliters of medium into each well of an eight well chamber slide for a 16 hour culture at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. After thawing, add 10 microliters of the purified fluorescent labeled exosomes to each well and return the cell cultures to the incubator for one hour. At the end of the incubation, wash the cells with PBS and fix each co-culture with 1%paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature.Remove the medium and then mount the slide with medium supplemented with DAPI and image the samples by fluorescence microscopy at a 40 times magnification. To verify exosome interaction with recipient cells, seed two times 10 to the fifth mouse lung epithelial 12 cells in two milliliters of medium per well in a 12 well culture plate containing the appropriate culture medium for a two hour incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. At the end of the incubation, add 20 micrograms of exosomes to three wells of epithelial cells per experimental group and return the cells to the incubator.After 24 hours, remove the medium, wash the cells with PBS, and add 600 microliters of lysis buffer to each well with gentle shaking. Then transfer the entire contents of each well into individual 1.5 milliliter tubes and analyze the samples according to the standard real time PCR protocols. Within 24 hours of LPS administration, neutrophilic influx is observed in the lungs of LPS treated animals.After their isolation and purification as just demonstrated, the presence of exosomes in the BOLF from septic lung injury animals can be confirmed by transmission electron microscopy. The expression of select pro-inflammatory micro RNA is significantly increased in bronchoalveolar fluid exosomes from LPS treated animals compared to controlled PBS treated mice. LPS treated exosomes are taken up by mouse bronchiole epithelial cells as evidenced by the co-localization of fluorescent dye labeled exosomes with DAPI labeled cells after one hour of co-culture.Pro-inflammatory mediator expression is significantly increased in epithelial cells co-cultured with exosomes from LPS treated animals compared to co-culture with exosomes from control PBS treated mice. Further, cells treated with exosomes from LPS treated mice demonstrate a significantly attenuated expression of zonula occludens one compared to controls indicating a less intact cell integrity after LPS treated exosome co-culture. The intra-peritoneal injection of LPS, the bronchoalveolar lavage extraction, and exosome delegation from the bronchoalveolar lavage all the steps can be completed in a relatively short amount of time.Following this procedure, other methods like exosome and epithelial cell co-culture can be performed to answer additional questions about the cross talk between innate and structural cells in the lung alveolar micro-environment. Cross talk between innate immune and structural cells via exosome shuttling contributes to the inflammatory response and to structural barrier disruption suggesting exosomal micro-RNA targeting may provide a normal platform for treating acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. After watching this video you should have a good understanding of how to induce septic lung injury in mice, isolate bronchoalveolar lavage fluid from mice, isolate exosomes from the lavage fluid, and use a co-culture model for interrogating intracellular cross talk.Don't forget that working with LPS can be hazardous and that precautions such as wearing the appropriate personal protective equipment should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...