Name: bronchoalveolar lavage exosomes in lipopolysaccharide-induced septic lung injury
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00
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Los autores han declarado no hay conflicto de intereses.

El protocolo general requiere de 2 días, incluyendo el primer día de la inducción de la sepsis y el aislamiento del líquido del BAL de la animal y el segundo día para aislamiento de exosomas de ratón BALF. Todos los procedimientos han sido revisados y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso centro médico VA de Atlanta.
1. modelo de lesión pulmonar aguda séptica ratón
<ol><li>Use 6-8 semanas - viejo tipo C57BL/6J ratones machos (20-22 g de peso) para el animal modelo...

<ol>
	<li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury.">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li><li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease:+potential+and+pitfalls.">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li><li>Han, S., Mallampalli, R. 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Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li><li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Critical+Illness.">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li><li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li><li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+in+Lung+Disease.">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. 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Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease.">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li><li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea.">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li><li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues.">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li><li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection.">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li><li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade.">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry &amp; high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine.">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li><li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice.">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide.">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li><li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators.">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li><li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy.">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , 221-232 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+(MDM)+and+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSC).">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li><li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li><li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection.">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li><li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma.">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma:+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods.">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686 (2015).</li><li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties.">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li></ol>

Modelos murinos de enfermedades se utilizan comúnmente para evaluar la función fisiológica de genes específicos y reducir el costo de experimentación2. La lesión pulmonar aguda séptica descrita aquí imita la respuesta inflamatoria en los seres humanos con SDRA. Este modelo es pertinente para investigar la patogenesia molecular, desarrollo de biomarcadores y para probar terapias de nuevo potencial5.
Sistemas de co-cultivo son relevantes pa...

LPA y el SDRA es las formas mortales de la insuficiencia respiratoria con hipoxemia severa causada por edema pulmonar no cardiogénico que afecta aproximadamente de 1 millón personas anualmente1. La etiología del SDRA incluye una lesión directa a los pulmones de las infecciones o aspiración y una variedad de insultos indirectos. En la última década ha habido una mayor comprensión de la patogenia molecular del SDRA, sin embargo, tratamientos específicos específicos para ARDS todavía ser desarrollado2,3.
Se han desarrollado varios modelos animales de lesión pulmonar aguda que proporcionan un puente para la traducción de terapias experimentales para los estudios en humanos4,5. Modelos comúnmente usados incluyen la instalación local de ácido oleico, bacterias, LPS y bleomicina. Otros métodos incluyen isquemia-reperfusión, punción cecal ligadura, lesión de estiramiento inducido por la ventilación mecánica, hiperoxia o la administración sistémica de bacterias y LPS5. Estos modelos proporcionan un sistema biológico útil para probar las hipótesis clínicas y para el desarrollo de terapias potenciales. Para simular el SDRA humano, modelos animales deben reproducir la inflamación y la lesión aguda a las células epiteliales y endoteliales con defectos en la función de barrera en los pulmones.
Exosomas son vesículas de membrana con 20 y 200 nm de diámetro, cuyo contenido molecular contiene proteínas, ADN, ARN y lípidos, y facilitan la comunicación inter celular en el microambiente del tejido mediante transferencia de composición molecular. Exosomas son secretadas por varios tipos de células, como células endoteliales, células epiteliales, las células musculares lisas y células del tumor y existen en el líquido de cuerpo humano. Estudios indican que los exosomas regulan entre las células inmunes y células del estroma durante enfermedades inflamatorias infecciosas y estériles, y su liberación anormal parece ser regulada por diversos estímulos naturales y experimentales durante fisiológico y procesos patológicos6. Dicha red de comunicación puede jugar un papel importante en la patogenesia de enfermedades pulmonares y puede afectar la progresión fisiopatológica7,8. 18-22 como nucleotide RNAs no codificantes, los miRNAs existen en tejidos y líquidos corporales, plasma, sueros y modulan la expresión del mRNA a poste-de translación nivel9,10.
Envasados miRNAs en exosomas influyen en la diferenciación y función de múltiples tipos de células, y niveles excesivos están asociados con una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades pulmonares, obesidad, diabetes y enfermedad cardiovascular11, 12,13,14,15,16. Entrada en las células del receptoras y realizar trayectos de miRNAs de exosomal facilitar la comunicación intercelular modificando la hemostasia del microambiente17,18. Lesión pulmonar aguda es un procesos complejos, que involucran a múltiples tipos de células con extensas comunicaciones intercelulares a través de exosomas8. miR-155 y miR-146a comparten el mecanismo de regulación transcripcional común y contribuyan a la respuesta inflamatoria y la tolerancia inmunológica19,20. Estudios recientes indican que ambos modulan la respuesta inflamatoria mediante exosomal miRNAs realizar la transición entre las células inmunes21. Sin embargo, todavía no están claros los mecanismos moleculares subyacentes a efectos moduladores de miRNAs exosomal alveolar respuesta a endotoxinas, sin lugar a dudas el potencial relevancia clínica y traslacional implicación mérito más investigación.
Modelos de cocultivo se están empleando para definir la interacción de los tipos de células específicas en el entorno complejo, como inflamación y cáncer22,23. Estas plataformas proporcionan una estrategia alternativa para interrogar entre tipos celulares especialmente para las células inmunes y estructurales.
Intra-traqueal, administración aerosolizada, intraperitoneal o sistémica de LPS son ampliamente utilizados para inducir lesiones de pulmón experimental24,25,26y han demostrado para inducir la permeabilidad endotelial y epitelial defectos. Aquí utilizamos LPS intraperitoneales para inducir un modelo séptico de lesión pulmonar aguda en ratones. Dentro de las 24 h de la administración intraperitoneal de LPS, defectos de la permeabilidad son inducidos en los pulmones con el reclutamiento de células inflamatorias. Además, demostramos que los exosomas de BAL contienen miRNA-155 y miR-146a, y exosomas de líquido del BAL inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias en células epiteliales receptores, incluyendo IL-6 y TNF-α. Estos datos son los primeros en Mostrar exosomal miRNAs son secretadas en BAL en este modelo de lesión pulmonar aguda séptica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1276px;" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:691px;">lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">Escherichia coli 055:B5</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS pH7.2(1X)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mirVana miRNA isolation kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">449774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mmu-miR-155 (002571) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">has-miR-146a (000468) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U6snRNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF-&#945;(Mm00443258_m1 ) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IL-6 (Mm00446190_m1&#160;&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZO-1 (Mm00493699_m1&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">minimal essential medium (MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11095-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trysin-EDTA solution(0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome Spin Columns (MW3000)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4484449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L-100XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transmission electron microscopes (TEM)</td>
			<td>JEOL Ltd</td>
			<td>120 kV TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus BX41 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX41</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage exosomes in lipopolysaccharide-induced septic lung injury

Lesión pulmonar aguda (ALI) y síndrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) representan un grupo heterogéneo de enfermedades pulmonares que sigue teniendo una alta morbilidad y mortalidad. La patogenia molecular de ALI está mejor definido; sin embargo, debido a la compleja naturaleza de la enfermedad terapias moleculares han desarrollado. Aquí utilizamos un modelo del ratón inducida por lipopolisacárido (LPS) de la lesión pulmonar aguda séptica para delinear el papel de los exosomas en la respuesta inflamatoria. Usando este modelo, hemos podido demostrar que ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar de los pulmones que se empaquetan con miRNA y citoquinas que regulan la respuesta inflamatoria. Además utiliza un sistema de modelo de co-cultivo, mostramos que exosomas liberados de los macrófagos alteran la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales. Estos resultados sugieren que 1) diafonía entre células inmunes y estructurales innatas a través de la exosomal realizar trayectos contribuyen a la respuesta inflamatoria y alteración de la barrera estructural y 2) dirigidos a estos miRNAs puede proporcionar una nueva plataforma para tratar ALI y SDRA.

Para inducir lesión pulmonar séptico, los ratones fueron tratados con LPS intraperitoneales (15 mg/kg). Dentro de las 24 h de la administración de LPS, neutrophilic afluencia fue visto en los pulmones, como se muestra en la figura 1A. Líquido del BAL de ratón fue dibujado, seguido por el aislamiento y purificación de exosomas. Morfología de exosomas BALF fue confirmado por microscopia electrónica de transmisión (figura 1B</strong...

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Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar que se empaquetan con miRNAs. Utiliza un sistema de cocultivo, demostramos que los exosomas liberados en el líquido del BAL interrumpen la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales y aumentan la expresión de citoquinas pro-inflamatorias que acentúan la lesión pulmonar.

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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