Name: visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Wir danken Dr. Mustafa Khokha, Yale University, für die Bereitstellung von seinem Labor Ressourceneinsatz. Wir sind dankbar, Herr Wu Ming Jie für ausgezeichnete technische Unterstützung. EF ist ein HHMI Investigator. Diese Arbeit wurde durch ein Geschenk von John Monsky und Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund unterstützt.

1. Vorbereitung der DNA-Templates
<ol><li>Die 16 s rRNA Sequenz spezifische auf jede bakterielle Gattungen von NCBI Datenbank und Design Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kompatibel vorwärts herunterladen und reverse Primer, die Gattungen-spezifische Regionen (~ 200-250-Basenpaare lang) verstärken werden, wie oben beschrieben 19. Siehe auch die open-Source-Datenbanken SILVA20,21 und ProbeBase22 Online-Ressourcen f...

<ol>
	<li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission:+Translational+Aspects.">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).</li><li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut.">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li><li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. 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D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks.">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li><li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphofunctional+changes+in+the+midgut+of+Ixodid+ticks+during+the+life+cycle.">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li><li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+a+microbiome+study.">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87 (2014).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li><li>Frank, D., Harland, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Dies ist die erste Verwendung einer vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH)-Technik, die Mikrobiota ein Arthropoden Vektor von Krankheitserregern zu studieren. Unser Protokoll wurde von einem zur Entwicklung von Drosophila und Frosch-Embryonen25,26Untersuchung angepasst. Vollständig-hängen RNA in Situ Hybridisierung wurde routinemäßig verwendet, um gen Transkripte räumlich zu lokalisieren und zeitlich2...

Mensch und Vieh Krankheitserreger übertragen durch Arthropoden Vektoren finden sich weltweit und entfallen etwa 20 % von Infektionskrankheiten weltweit1, aber effektiv und sichere Impfstoffe gegen die meisten dieser Erreger sind nicht verfügbar. Unser Verständnis für die Bedeutung von Kommensalen, symbiotische und pathogenen Mikroorganismen, zusammen bekannt als Mikrobiom2, Modulation und Formen die Gesundheit fast aller Metazoen3 erweitert. Es ist nun offensichtlich, dass Arthropoden Überträger von Krankheitserregern auch Darm Microbiota Hafen und dieser Vektor-assoziierten Mikrobiota haben gezeigt, dass verschiedene Vektoren übertragene Krankheitserreger4,5beeinflussen. Die Arthropoden Microbiome besteht aus Eubakterien, Archaeen und Viren eukaryotic Mikroben wie Protozoen, Nematoden und Pilze6. Aber wurde die vorherrschende Forschungsschwerpunkt Eubakterien zurückzuführen, zum Teil, um die Verfügbarkeit von Markergenen und Referenzdatenbanken, bestimmte bakterielle Mitglieder zu identifizieren.
Mit einem Fokus auf Ixodes Scapularis, die Zecke Vektor mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi7, einschließlich der Erreger der Lyme-Borreliose, die Optimierung der mikrobiellen Visualisierungstechnik zielte ein besseres Verständnis der Zecke Darm Microbiota im Zusammenhang mit Vektor-Pathogen Interaktionen. Einige Fragen bleiben, um im Feld Tick Microbiome beantwortet werden. Der Darm ist die Website der erste längere Begegnung zwischen der Zecke und der eingehenden Erreger im Zusammenhang mit horizontal übertragenen Krankheitserreger; Daher wird das Verständnis der Rolle der Vektor Darm Microbiota Modulation Vektor-Pathogen Interaktionen aussagekräftige Erkenntnisse offenbaren. Zecken haben eine einzigartige Art der Blutmahlzeit Verdauung, wo Platz Verarbeitung der Blutmahlzeit Komponenten erfolgt intrazellulär8. Die Darm-Lumen scheinbar dient als Gefäß für die Blutmahlzeit der Zecke Feeds enthalten, und Nährstoff Verdauung und Assimilation ergeben in den Tagen der Fütterung und weiter nach Übersättigung. Die Krankheitserreger erworben von der Zecke während der Fütterung geben Sie das Darm Lumen zusammen mit dem Blutsaugen und somit das Lumen eines primären Standorts von Interaktionen zwischen den Tick, Erreger und resident Mikrobiota. Im weiteren Verlauf Verdauung durch die Kalorienzahl und Ixodid Häckchen Häutung erfährt der Darm strukturelle und funktionelle Veränderungen9. Die Zusammensetzung und die räumliche Organisation der Darmbakterien dürfte auch im Konzert mit den wechselnden Darm-Milieu zu variieren. Deshalb ist es wichtig, die Architektur der ansässigen Bakterien im Darm zu verstehen, das Zusammenspiel von Tick, Erreger und Darm Microbiota Tick zu verstehen.
Molekulare Techniken, um Host-assoziierten Mikrobiota routinemäßig beschreiben nutzen parallel Hochdurchsatz-Sequenzierung Strategien10 zu verstärken und zu sequenzieren bakterielle 16 s ribosomalen DNA (rDNA). Diese Abfolge Strategien umgehen axenic Kulturen von bestimmten Bakterien zu erhalten und bieten eine ausführliche Beschreibung aller bakteriellen Mitglieder in der Stichprobe vertreten werden müssen. Dennoch sind solche Strategien durch die Unfähigkeit, ökologische Verunreinigungen von Bona Fide Bewohner unterscheiden verwechselt. Weiter, bei der Beurteilung von Proben, wie Zecken, die sind klein und daher enthalten geringe Mikrobiota-spezifische DNA ergibt, die Wahrscheinlichkeit der Verstärkung von Umweltschadstoffen erhöhte11 und führt die zweideutige Interpretation des Microbiome Zusammensetzung. Funktionelle Charakterisierung in Verbindung mit der Visualisierung von bestimmten lebensfähige Bakterien, daher werden kritisch zu definieren und zu erkennen das Mikrobiom der Zecke, zeitlich und räumlich. Auf dieses Ziel nutzten wir die gesamte-Mount RNA in Situ Hybridisierung. Diese Technik wird routinemäßig verwendet, um gen Expressionsmuster in Organen und Embryonen12,13,14 beurteilen und ermöglicht semiquantitative Analyse des Ausdrucks über die gesamte Stichprobe von Interesse. Dies unterscheidet sich von traditionellen in Situ Hybridisierung Techniken die Gewebeschnitte nutzen und erfordern häufig umfangreiche Analyse des geschnittenen Materials mit einer rechnerischen Versammlung Ausdruck in ganze Organe15vorherzusagen. Während vollständig-hängen in der Regel auf ganze Organismen12bezieht, bezieht sich hier ganze-Mount auf ganze Eingeweide und Organe. Die Vorteile der Verwendung von ganz-Mount RNA in Situ Hybridisierung Ansatz um zu beurteilen, die Architektur der Zecke Darm Microbiota sind vielfältig. Die Zecke Darm besteht aus 7 Paar Divertikel, jedes Paar unterschiedlicher Größe16. Die funktionalen Unterschiede, wenn jemand unter dieser Divertikel nicht im Zusammenhang mit der Zecke Biologie verstanden werden kreuzen Mikrobiota oder Tick-Pathogen Interaktionen. Manipulationen des Darms, die den Darm Divertikel platzen würde Mikrobiota in das Lumen des Darms oder die lose mit den Darm und führen zu Fehlinterpretationen der räumliche Lokalisation der Mikrobiota verdrängen. Fluoreszenz-markierte RNA in Situ Hybridisierung wurde früher verwendet worden, um Tick Darm Transkripte17 untersuchen durch Fixierung und öffnen einzelne Darm Divertikel Sonde Hybridisierung zu gewährleisten und B. Burgdorferi zu lokalisieren Abschriften von Paraffin-eingebetteten ganze Zecken18-Schnitt. Beide Ansätze erfordern Manipulationen der Zecke Gewebe vor der Hybridisierung, die die Darm Microbiota Architektur beeinflussen würden.
In diesem Bericht beschreiben wir ausführlich das Protokoll um tragfähige Tick Darm Microbiota mit vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH) zu untersuchen. Die Verwendung von ganzen-Mount RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht ein globales Verständnis der Gegenwart und Fülle von bestimmten Darmbakterien in den verschiedenen Regionen des Darms und kann neue Einblicke in die Zecke Darm Biologie im Rahmen des Erregers Kolonisation Sporn und Getriebe. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von RNA-Sonden, die gegen bestimmte bakterielle RNA Erkennung von lebensfähigen Bakterien im Darm von Zecken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1079px;" width="1079">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td>
			<td style="width:220px;">Amazon</td>
			<td style="width:348px;">03-110/47</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pGEM-T Easy Vector System</td>
			<td style="width:220px;">Promega</td>
			<td style="width:348px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Digoxygenin-11-UTP</td>
			<td style="width:220px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1209256910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">dNTP</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:348px;">N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNAse I(RNAse-free)</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2070S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Water, RNase-free, DEPC-treated</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB02128-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA, 0.5M, pH 8.0</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formaldehyde, 37%</td>
			<td style="width:220px;">JT Baker</td>
			<td style="width:348px;">2106-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formamide</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00600-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">E-4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DPBS, 10X</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:348px;">14300-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tween-20</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">P1379-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Triethanolamine HCl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">T1502-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">320102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific/Pierce</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">SSC, 20X</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB13156-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNA from torula yeast</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">R3629-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin, sodium salt</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Denhardt&#39;s Solution, 50X</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">D2532-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">CHAPS hydrate</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">C3023-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase A</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase T1</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Maleic acid</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">M0375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Levamisol hydrochloride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">31742-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:320px;">Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">HT10132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:220px;">Mallinkrodt Baker, Inc</td>
			<td style="width:348px;">2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Single stranded RNA ladder</td>
			<td style="width:220px;">Ambion -Millenium</td>
			<td style="width:348px;">AM7151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;#11 High-Carbon steel blades&#160;</td>
			<td style="width:220px;">C and A Scientific Premiere</td>
			<td style="width:348px;">#11-9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:220px;">BioRad, CA</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">NanoDrop 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">DS-500E Digital Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:220px;">BELLCO Glass, Inc</td>
			<td style="width:348px;">Hot Shaker-7746-12110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Gel&#160; documentation system</td>
			<td style="width:220px;">BioRad</td>
			<td style="width:348px;">Gel Doc XR+ Gel documentation system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Nikon</td>
			<td style="width:348px;">NikonSM2745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">AXIO Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">STEMI 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Light box</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">102097-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PCR purification kit&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image capture software</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">Zen lite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image editing software&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Adobe&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;">Automation compatible instrumentation</td>
			<td style="width:220px;">Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Intavis, Biolane HT1.16v</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Infektionskrankheiten, die durch Arthropoden Vektoren übertragen weiterhin eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit weltweit dar. Die Erreger dieser Krankheiten verursachen existieren nicht isoliert, wenn sie den Vektor kolonisieren; vielmehr führen sie wahrscheinlich Interaktionen mit ansässigen Mikroorganismen im Darm Lumen. Die Vektor-Mikrobiota nachgewiesen wurde, eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Erreger für mehrere vektorübertragene Krankheiten. Ob ansässige Bakterien im Darm der Zecke Ixodes Scapularis , der Vektor der mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi, einschließlich Tick Übertragung von Krankheitserregern beeinflussen werden nicht bestimmt. Wir benötigen Methoden zur Charakterisierung der Zusammensetzung der Bakterien ermöglichen ein besseres Verständnis der Interspezies Wechselwirkungen im Darm Tick Tick Darm zugeordnet. Mit vollständig-hängen in Situ kann Hybridisierung, RNA-Transkripte, die verbunden sind mit bestimmten Bakterienarten zu visualisieren für die Sammlung qualitativer Daten in Bezug auf die Häufigkeit und Verteilung der Mikrobiota in intaktem Gewebe. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen im Darm Microbiota Milieu im Laufe der Zecke, die Fütterung zu überprüfen und kann auch angewendet werden, um die Expression von Genen Tick zu analysieren. Färbung des ganzen Tick Eingeweide Ausbeute Informationen über die grobe räumliche Verteilung der Ziel-RNA im Gewebe ohne die Notwendigkeit für dreidimensionale Rekonstruktion und weniger Umweltverschmutzung, die häufig die Sequenzierung-basierte verwirrt betroffen ist Methoden, die häufig verwendet, um komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu studieren. Insgesamt ist diese Technik ein wertvolles Instrument, das besser genutzt werden kann Vektor-Erreger-Mikrobiota Interaktionen und ihre Rolle bei der Übertragung von Krankheiten zu verstehen.

Die Messung und Einschätzung der Qualität der RNA-Sonden sind kritische vor Beginn der Färbung. In-vitro- Transkription Effizienz hängt in hohem Maße auf die Menge und Qualität der DNA-Vorlage. Wir visualisieren routinemäßig die RNA-Sonden auf einem Formaldehyd-Gel zur Überprüfung der Reinheit und Menge der Sonde durch die Transkription Reaktionen erzeugt. Die Sonden erscheint als helles, diskrete Banden (Abbildung 2). Photometrische Messun...

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

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micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

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Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...