Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM113602 (الحركة) وجبهة الخلاص الوطني 1144247 (AL). ونعترف سلابودنيك مارك وناتالي كيركلاند لتطوير الإصدارات الأولية من بعض من هذه البروتوكولات ومناقشات غنية بالمعلومات. ونحن نشكر بيرلازا كارينا ولويس غريسون لقراءة نقدية من المخطوطة.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

استزراع ستنتور يعرض عددا من التحديات. أولاً، لإجراء التجارب التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا، يحتاج المرء الإبقاء على عدد كبير من الثقافات ستنتور ، كثقافات تصبح غير صحية عندما يتجاوز تركيز ستنتور 20 خلايا/مل. ثانيا، الكائنات الحية التي يمكن أن تلوث الثقافات ستنتور غالباً ما تقسم أسرع من ستنتور وتطغى الثقافة (وهو الملوثات شائعة الروتيفر). وبالتالي، من الضروري أن تفقد الثقافة تحت مجهر بشكل دوري وإزالة الملوثات. في بعض الأحيان، يحتاج ثقافة جديدة ليبدأ من عدد صغير من الخلايا التي أنقذت يدوياً من ثقافة ملوثة. وهذا يزيد من الوقت اللازم للمحافظة على صحة جيدة ستنتور الثقافات. ثالثا، توسيع خلية واحدة إلى ثقافة 400 مل يتطلب شهر واحد على الأقل لدورة الخلية ستنتور من 3-5 أيام. رابعا، خلافا للنموذج الآخر سيلياتيس، ستنتور نادراً ما تذهب إلى شكل كيسه وأنهم لا يمكن أن تجمد.
جانبا مهما من استزراع ستنتور هو اختيار كائن حي الغذاء المناسب. أساليب مختلفة لاستزراع ستنتور وصفت سابقا. واحد منهم يقترح استخدام اللبن المقشود للبكتيريا الثقافة التي تغذي ثم ستنتور. هذه تقنية فعالة في استزراع ستنتور؛ ومع ذلك، يتطلب تطبيق تقنيات الجينوم عينات نقية لتجنب الارتباك الناجم عن قراءة الجينوم من الكائنات الحية الغذاء غير معروف. استخدام البروتوكول الحالي، يمكن زراعتها ستنتور في الكتلة و، لأنه قد تم تعيين تسلسل طعامهم، تشلاميدوموناس،، يمكن الكشف عن وجود تلوث الجينوم من الكائنات الحية الغذاء وتسيطر عليها. لأسباب غير معروفة، كان التكلس تجديد المخزونات له بالعودة إلى حيث وجد ستنتور قبل. مع البروتوكول الحالي، وقد تمكنا من إبقاء ستنتور لسنوات.
تجارب التجديد مع ستنتور واضحة عموما، ولكن هناك بعض التفاصيل الهامة نضع في اعتبارنا. وفيما يتعلق بالمادة 2، قطع ستنتور يمكن أن يتقن الخلايا في نصف دقيقة. وقد يتطلب إتقان إجراءات الجراحة أكثر تقدما من ستنتور أسبوع ممارسة. وفي حين أداء علاج السكروز أو اليوريا (الجزء 3)، إذا في بداية تصوير معظم الخلايا لا تزال تلك العصابات ميمبرانيلار، زيادة وقت الحضانة من 10-30 ثانية لعندما يتم تنفيذ المعاملة السكروز التالية. لا تزيد وقت المعاملة السكروز خارج الحضانة 3 دقيقة نظراً لأنه سوف يؤدي إلى موت الخلية.
التصوير من ستنتور يتطلب تجديد الأساليب بصورة كبيرة الخلايا على مدى فترات طويلة من الزمن. يمكن استخدام أسلوب التصوير بالتفصيل في القسم 4 فقط مع مجهر تستقيم. ثم إذا كان متوفراً مجهر مقلوب بدلاً من ذلك، يمكن وضع الخلايا على الشريحة أو ساترة في الدوائر الصغيرة. أسلوب واحد إنشاء دائرة من فازلين وتغطي مع آخر ساترة لمنع التبخر. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء دائرة لخلية مفردة بصنع حفرة لكمه ثقب من الحجم المطلوب في 1 × 1 سم2 مربعة من مباعدة السيليكون (الجدول للمواد)، وضع فاصل على ساترة، ووضع الخلايا في قاعة ، والتي تغطي الدائرة مع ساترة آخر. عند التصوير، وإذا لم ستنتور في الاتجاه الصحيح مراعاة السمات المميزة لكل مرحلة من التجدد، اضغط على لوحة بحزم لجعل العقد من الخلية. مشاهدة الخلية تمتد إلى تحديد مرحلة التجديد (ملحق كامل يأخذ حوالي 45 ثانية). إذا كانت الخلية لا تزال في اتجاه خاطئ، كرر التنصت. واتخذت هذه الصور هو مبين في الشكل 1 و الشكل 6 مجهر تكبير ستيريو؛ ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب بالتفصيل استخدام 5 × تشريح مجهر ستيريو.
يتمثل التحدي الآخر إلى جانب استزراع والتصوير ستنتور تتبع للتجديد، على وجه التحديد مقدار الوقت اللازم التعرف على مراحل. إذا كانت الخلية تجديد المنحى تماما مع منطقة بريمورديوم الشفوية واضحة للعيان، تحديد المرحلة التي تستغرق بضع ثوان. في بعض الأحيان، ومع ذلك، الخلية ستنتور في اتجاه الحيلولة دون تحديد واضح لمرحلة التجديد، ومن ثم أخذ مزيد من الوقت لتحديد. القدر الكبير من الوقت المطلوب لمرحلة الخلايا تجديد الفردية قد يؤخر التقدير الكمي للخلايا تجديد كافة، وبالتالي تقليل الدقة الزمنية التدريج والتي تتطلب المراقب الانتظار وإعادة الصورة الخلية بعد ذلك انتقل إلى توجه جديد. ونتيجة لذلك، هي هذه التجربة المرة وكثيفة العمالة. لهذه الأسباب، سيكون من المرغوب فيه جداً لتطوير أساليب مؤتمتة للكشف عن الخلايا ستنتور وتعيين مراحل التجديد في بيانات الفيديو مجهرية. هذه سوف تسمح أيضا لمزيد من التجارب استنساخه، زيادة في حجم العينة، وإزالة التحيز القائم على البشرية.
قد بدأ ظهور أساليب الجينوم والبروتين حساسة للغاية لوضع دراسات للخلايا المفردة في الوصول. لمثل هذه التحليلات خلية واحدة، يجعل حجم خلية ستنتور العملاقة موضوع اختبار المرغوب فيه لتجارب إثبات المفهوم. لهذه التجارب وذلك يكون من الممكن، استزراع ستنتور هو أمر أساسي، ومن ذلك الأساليب الموصوفة هنا ينبغي أن تلعب دوراً في زيادة تطوير تقنيات أكثر تقدما من خلية واحدة.

الخلايا غير أكياس بسيطة من الإنزيمات، ولكن آلات معقدة للغاية بدلاً من عناصرها يتم تحجيمها إلى الحجم الصحيح بعناية ومرتبة في مواقف محددة تحديداً جيدا. Morphogenesis الخلايا الفردية يمثل عملية رئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي، لكن آليتها الجزيئية غير معروف1،2. في حين تشبه بعض الخلايا المستزرعة النقط، الكائنات الحية أحادي الخلية يمكن أن يكون معقداً للغاية أبنية، يتجلى في أنماط معقدة القشرية ينظر في سيلياتيس3،4.
ربما هو المثال الأكثر تطرفاً لخلية التنظيم كويروليوس ستنتور، بعيد تتصل هيتيروتريتشوس عملاقة سيلياتي تيتراهيمينا و براميسيوم. ستنتور 1 مم طويل ومغطى بشرائط طولية أكثر من 100 من صبغة زرقاء بالتناوب مع صفوف من أهداب تنظمها المكدسات المتوازية من شرائط ميكروتوبولي التي تعمل طول الخلية بأكملها. الخلية البوق-يتشكل (الشكل 1)، مع عصابة ميمبرانيلار وجهاز عن طريق الفم (الزراعة العضوية) في نهايته الأمامية، وهولدفاست التي تعلق الخلية إلى الركيزة في نهايته الخلفية. الخلية بالإضافة إلى قطبية واضحة الأمامي الخلفي، كما يبين الزخرفة مراوان مميزة، مثل أن التباعد بين صفوف الهدبية تدريجيا الزيادات في اتجاه عقارب الساعة. ينتج عن هذا انقطاع حيث يجتمع الصف أضيق الصف أوسع، وهذه المنطقة من سطح الخلية، المعروفة باسم محور التباين شريطية، يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجموعة الثانية من هياكل نهاية الأمامي عند المطعمة على آخر خلية5، مما يعادل رسميا منظم سبيمان. وهكذا، يكون جميع العمليات الرئيسية لعلم الأحياء التنموي على النظير في ستنتور: أكسياتيون وتشكيل نمط التعريفي. في جنين، هذه العمليات هي مدفوعة بمصير الاختلافات بين خلايا مختلفة، ولكن في ستنتور، وأنهم يجب أن يكون مدفوعا بمصير الفروق بين المناطق المختلفة داخل خلية واحدة. ما يحدد الاختلافات بين المناطق داخل ستنتور لغزا.
إذا تم اقتطاع أي جزء من ستنتور ، يمكن تجديد القطعة المفقودة من الخلية تسفر عن خلية عادية في غضون ساعات. إذا كانت خلية قطع في نصف، أو حتى إلى قطع أصغر بكثير، كل قطعة يعيد إلى خلية يبحث عادي ولكن أصغر حجماً ويعيد التناسب الصحيح بين خلية أجزاء6،7. أجزاء صغيرة حتى، 1/64th حجم الخلية الأصلية، وقادرة على التجدد في زنزانة صغيرة ولكنها تتناسب عادة ومن ثم تنمو إلى الحجم الكامل6. ستنتور وبالتالي من فرصة فريدة لدراسة آليات عضية الحجم التحجيم خلية نمو التنظيم واستخدام الطرق الجراحية التي تطبق عادة على مستوى الأنسجة أو الكائنات الحية كلها.
واحدة من خصائص ستنتور التي يسمح لها بتجديد من طائفة واسعة من العمليات الجراحية يحتوي ماكرونوكليوس نودولاتيد واحد (الشكل 1) مع حوالي 50 ألف نسخة ل الجينوم الكامل8. ما دام جزء من خلية تحتوي على عقده واحدة على الأقل ماكرونوكلير، لديها القدرة على تجديد تماما. خاصية أخرى الكامنة وراء قدرة التجدد ستنتورهو قدرته المذهلة التئام الجروح. وعلى الرغم من العديد من أنواع الخلايا قادرة على شفاء الجروح على9، ستنتور قادراً على استرداد من مجموعة غير عادية من الاضطرابات الجسدية. وأفيد سابقا مثالاً لاسترداد ستنتور من اضطراب جذري، جنبا إلى جنب مع الأساليب لتصور تدفق هيولى في ستنتور10 . تسمح هذه الطرق دراسة كيفية إصابة واللاحقة تؤثر تجديد الحالة المادية السيتوبلازم.
ستنتورضخمة الحجم والقدرة على التجديد غير عادية، وحقيقة أن ذلك يظهر العديد من الظواهر الإنمائية التي ينظر في أجنة متعددة الخلايا (مثل المنظمين، أكسياتيون، والزخرفة) اجتذبت العديد من علماء الأحياء التنموي خلال مطلع القرن الماضي، بما في ذلك "توماس هانت مورغان"7. خلال 50 عاماً وال 60، أثبت النهج microsurgical مجموعة مذهلة من عمليات التجدد ومورفوجينيتيك في هذا الحي وحيدة11. ومع ذلك، ستنتور قد وضعت كنظام نموذجي لبيولوجيا الجزيئية إلا في الآونة الأخيرة. خلال السنوات القليلة الماضية، كان تسلسل جينوم ستنتور وجمعت8، وكان الأسلوب للتشويش التعبير الجيني باستخدام [رني] عن طريق تغذية المتقدمة12.
وكان أحد الأسباب أن ستنتور قد تطورت إلى كائن نموذج للبيولوجيا الجزيئية الحديثة فقط مؤخرا صعوبة متزايدة الثقافات الكبيرة نظراً لدورة الخلية طويلة (3 إلى 5 أيام). ومع ذلك، تتطلب أساليب الجينوم والبروتين الحديثة المواد أقل مما كانوا، وحجم خلية ستنتور واحدة كافية لهذه الأساليب، حتى بدون اللجوء إلى أساليب أولتراسينسيتيفي التي تم تطويرها لتحليل واحد الخلايا التي أصغر بكثير من ستنتور. المادة 1 من البروتوكول تفاصيل الإجراءات المتعلقة بإرساء ثقافة كبيرة من خلية واحدة ستنتور . يمكن استخدام نفس النهج لإرساء ثقافة كبيرة من جزء خلية التي تم الحصول عليها عن طريق خفض خلية. كما يقدم الفرع 1 المبادئ التوجيهية للحفاظ على صحة ستنتور الثقافات على مدى فترات طويلة من الزمن. تنص المادة 2 من البروتوكول المنهجية لحفز التجدد الخليوي بقطع الخلايا يدوياً بإبرة زجاج. المادة 3 من البروتوكول مكرس لطريقتين لحفز تجديد هياكل خلية معينة (جهاز ميمبرانيلار الفرقة والفم): علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يؤدي إلى سفك هذه الهياكل، تليها بهم التجديد. المادة 4 من البروتوكول تفاصيل طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن. وينتهي القسم 4 مع وصف مراحل التجديد ونصائح حول تحليل ديناميات التجديد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus live culture</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>131598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii on agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>152040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, 1500 cP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>715740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cup glass container with glass lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1095600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureWell silicone sheet material</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher finest</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1379801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes. 
			OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B120-90-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller P-87</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the study of regeneration in stentor

الخلايا بحاجة إلى أن تكون قادرة على تجديد أجزائها على التعافي من الاضطرابات الخارجية. سيلياتي أحادي الخلية كوروليس ستنتور هو الكائن نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح وتجديد الخلايا اللاحقة. أن الجينوم ستنتور أصبح متاحاً في الآونة الأخيرة، جنبا إلى جنب مع طرق البيولوجيا الجزيئية الحديثة، مثل [رني]. هذه الأدوات تجعل من الممكن لدراسة تجديد خلية واحدة على المستوى الجزيئي. ويغطي الجزء الأول من البروتوكول ستنتور إنشاء خلية الثقافات من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، جنبا إلى جنب مع المبادئ التوجيهية العامة للحفاظ على الثقافات ستنتور . استزراع ستنتور بكميات كبيرة تسمح باستخدام أدوات قيمة مثل الكيمياء الحيوية، وتسلسلها، والطيف الكتلي. وتغطي الأجزاء اللاحقة من البروتوكول نهج مختلفة لحفز التجدد في ستنتور. قص الخلايا يدوياً بإبرة زجاجية تسمح دراسة تجديد أجزاء الخلية الكبيرة، بينما علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يسمح لدراسة تجديد هياكل محددة تقع في نهاية الأمامي للخلية. يتم توفير طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية، جنبا إلى جنب مع شعار التدريج وتحليل ديناميات التجديد. وتنقسم العملية برمتها من التجدد في ثلاث مراحل. بتصور ديناميات تطور عدد سكان خلايا عبر المراحل، يتضح عدم التجانس في توقيت التجدد.

أنشئت الثقافات ستنتور موثوق بها والحفاظ على من خلايا فردية أو أجزاء الخلية باستخدام المادة 1 من البروتوكول. ويرد مثال ممثل لثقافة صحية كبيرة في الفيديو 1.
وتم قياس مسار وقت التجديد في ستنتور استخدام أسلوب العلاج السكروز من أجل الشروع في تجديد المذكورة في "الخطوة 3-1"، جنبا إلى جنب مع التصوير وطريقة التحليل التي نوقشت في الفرع 4 (الشكل 7). هذه المؤامرة تشير إلى أن هناك فرقا استمرت ساعة واحدة في الوقت الذي يستغرقه السكان للخلايا للوصول إلى أي مرحلة معينة. يسمح هذا النوع من التحليل دراسة التغاير الزماني في عملية التجديد في عدد سكان لتجديد الخلايا.
ما يلي هو موجز لتوقيت التجديد التي لوحظت حتى الآن بعد عشرات من العلاجات السكروز (الشكل 4 و الشكل 6). المرحلة الأولى عندما الخلايا ستنتور تبدو وكأنها الدموع دون أي الفرقة ميمبرانيلار (هذه المرحلة يبدأ فورا بعد تبييض السكروز). وتستمر هذه المرحلة هو حاء 3-6 المرحلة 2 عند عصابة ميمبرانيلار يظهر وينمو (3-6 ح بعد العلاج السكروز). تستمر هذه المرحلة 3-4 ﻫ. المرحلة 3 هو عند بريمورديوم عن طريق الفم يظهر في نهاية مؤخرة الفرقة ميمبرانيلار (6-8 ح بعد العلاج السكروز)، ويتم نقل كل الهياكل نهاية الأمامي للخلية. وتستمر هذه المرحلة ح 1-2. عند الفرقة ميمبرانيلار وجهاز الشفوي، الذي تم التوصل إليه نهاية الأمامي للخلية، هذا وأشارت إلى انتهاء تجديد. وقد اعتمدت الخلية الشكل يشبه البوق ستنتور المميزة. وكانت الزنزانات تماما المجددة 8-9 ح بعد العلاج السكروز.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> الشكل 1. لقطة من ستنتور- وترد الفرقة ميمبرانيلار وجهاز الشفوي في نهاية الأمامي للخلية. هولدفاست نهاية الخلفي من الخلية. ماكرونوكليوس ستنتور نودولاتيد. وقد جيدا تغذية ستنتور الأخضر vacuoles الأغذية المحتوية على الأغلب Chlamydomonas. شريط مقياس هو 0.5 ملم. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> رقم 2. إنشاء قطع ستنتور - قطع الخلية يتم عن طريق التلاعب إبرة زجاج يدوياً بينما تبحث في الخلية باستخدام مجهر ستيريو تشريح متاحة تجارياً. والغرض من المناديل الورقية توفير خلفية بيضاء لرؤية خلايا الأفضل. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> الشكل 3. لقطات من الفيديو 3 توضح كيفية قص ستنتور بإبرة زجاجية. (A) A ستنتور فورا قبل الإبرة اللمسات عليه. (ب) ستنتور بلطف محشورة بين شريحة الإبرة والزجاج. A (ج) التعاقد مع ستنتور الرد على قوة الإبرة. (د) A ستنتور يجري خفض الضغط بلطف على الخلية مع الجانب من الإبرة. (ﻫ) A ستنتور قطع الآن في اثنين ولكن لا يفصل. (و) هما ستنتور الشظايا. هو شريط مقياس 0.25 مم. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> الشكل 4. التصور التخطيطي للمادة 3 والمادة 4 من البروتوكول. هذا بروتوكول مصورة لأداء السكروز أو علاج اليوريا والمراقبة لتجديد الخلايا. الوقت المحدد في أسفل لوحة تقاس من بداية الغسيل 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> الرقم 5. الإعداد للمراقبة التصوير و/أو مباشرة للتجديد مع مجهر تستقيم. في كل قطره 4 ميليلتر تتدلى من ساترة، وهناك خلية واحدة قيد التجديد. المياه في الآبار التي بليت بقعة الزجاج يحد تبخر القطرات. يسمح هذا الإعداد في أعقاب تجديد خلايا متعددة في نفس الوقت. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> الشكل 6. لقطات من ستنتور في كل مرحلة من الفرقة ميمبرانيلار وتجديد أجهزة الفم. (أ) المرحلة 1 تتميز بشكل خلية مثل الدمعة وغياب الفرقة ميمبرانيلار. (ب) المرحلة 2 يتميز بمظهر الفرقة ميمبرانيلار، وهيكل القائم على أهداب أن يدق باستمرار. عصابات ميمبرانيلار تتميز بخطوط متقطعة بيضاء في لوحات ب-دال (C و D) المرحلة 3 يتميز بمظهر بريمورديوم عن طريق الفم (ملحوظ مع سهم). بريمورديوم الشفوية يبدو وكأنه إينفاجينيشن في نهاية مؤخرة الفرقة ميمبرانيلار. سوف يتقدم بريمورديوم عن طريق الفم ثم صوب الأمامي للخلية ليصبح الجهاز عن طريق الفم. يتم إكمال التجديد (ه) عند الخلية قد اعتمد خاصية الشكل يشبه البوق ستنتور ، واتسعت على الجهاز عن طريق الفم (ملحوظ مع سهم) في نهاية الأمامي للخلية. هو شريط مقياس 0.25 مم. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> رقم 7. مكدس ارسم مربع إظهار كيفية تغيير أبعاد الخلايا في جميع مراحل التجديد بعد العلاج السكروز مع مرور الوقت. المؤامرة يظهر التباين في توقيت مراحل التجديد داخل سكان لتجديد الخلايا. "نهاية الصنع" يشير إلى انتهاء التجديد. عدد الخلايا: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> الفيديو 1 من . مثال على ثقافة صحية ستنتور - عموما، إذا ثقافة مركزة، تقسيم الثقافة من المستحسن. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> الفيديو 2 من . تباطؤ ستنتور مع ميثيلسيلولوسي- <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> الفيديو 3 من . قطع ستنتور- ويمكن خفض الخلايا الفردية يدوياً إلى قطع متعددة تحت ستيريو تشريح مجهر بضغط إبرة زجاج عن طريق الخلية. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مشكلة مع الثقافة</td>
			<td>علاج ممكن</td>
			<td>الوقاية الممكنة</td>
		</tr>
<tr>
<td>هو طغت الثقافة الروتيفر أو غيرها من الكائنات الكبيرة.</td>
			<td>إزالة العديد من ستنتور قدر الإمكان إلى طبق ثقافة جديدة. ثم تغسل الخلايا ثلاث مرات.</td>
			<td>يغسل ستنتور جيدا عند استلامها، حتى عند شرائها من مورد تجاري.</td>
		</tr>
<tr>
<td>الثقافة هي غارقة في الفطريات أو الكائنات الحية الصغيرة الأخرى.</td>
			<td>تحديد زاوية التي توجد فيها الأقل ستنتور. في هذا المجال، قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون إزالة العديد من ستنتور وإضافة كلمة جديدة. المزيج بلطف ولكن شاملة إلى ديستروبوتي الكائنات الغازية. تخطي تغذية القادم وسوف يأكل ستنتور لهم.</td>
			<td>مراقبة الثقافة بانتظام وإزالة الملوثات الصغيرة عن طريق تبادل الوسائط لكلمة جديدة.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
يتم وضع ستنتور فوق بعضها البعض.</td>
			<td>تقسيم الثقافة حيث يكون التركيز أقل من 20 خلايا/مل.</td>
			<td>تقسيم الثقافات أكثر في كثير من الأحيان.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
يتم التزاوج ستنتور الخلايا.</td>
			<td>تغذية كل 4 أيام بدلاً من كل 5 أيام.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الثقافة لديها الكثير من مواد النفايات الظلام.</td>
			<td>إزالة الكثير من المواد الداكنة، النفايات ستنتور بقدر الإمكان دون إزالة الخلايا. إذا تم إرفاق ستنتور مادة مظلمة، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً الإفراج عن الخلايا ستنتور من نفاياتها ثم قم بإزالة وسائط الإعلام مع النفايات دون إزالة الخلايا. أو إزالة تلك ستنتور وتغذية تبعاً لذلك أقل.</td>
			<td>تغذية ستنتور 1 مل أقل الغذائية في 100 مل ثقافة.</td>
		</tr>
<tr>
<td>يبحث الصحية (الرغوة/المتضخمة أو مقربة) ستنتور.
</td>
			<td>قم بإزالة الوسائط قدر ممكن دون إزالة الخلايا ستنتور كثيرة وإضافة كلمة جديدة.</td>
			<td>تبادل وسائل الإعلام بانتظام.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لاستزراع ستنتور.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

أساليب لدراسة التجديد في ستنتور

سيلياتي العملاقة، كوروليس ستنتور، نظام ممتاز لدراسة تجديد والتئام الجروح. نقدم الإجراءات لإنشاء ستنتور الثقافات الخلية من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، وحفز التجدد بقطع الخلايا، كيميائيا حفز التجديد للفرقة ميمبرانيلار والجهاز عن طريق الفم، والتصوير، وتحليل للخلية التجديد.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل<em&gt; في المختبر</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

أساليب لتحليل آثار اليورانيوم الطبيعي في أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...