Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de NIH grant R01 GM113602 (WFM) en NSF 1144247 (AL). Wij erkennen Mark Slabodnick en Natalie Kirkland voor de ontwikkeling van de oorspronkelijke versies van enkele van deze protocollen en voor informatieve discussies. Wij danken Karina Perlaza en Greyson Lewis voor kritische lezing van het manuscript.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kweken van de Stentor presenteert een aantal uitdagingen. Eerst, voor het uitvoeren van experimenten die grote aantallen cellen vereisen, moet een groot aantal Stentor culturen, handhaven als culturen worden ongezond als Stentor concentratie groter is dan 20 cellen/mL. Ten tweede, de organismen die Stentor culturen vaak besmetten kunnen sneller dan de Stentor verdelen en overweldigen de cultuur (een gemeenschappelijk verontreinigingen is raderdiertjes). Het is dus noodzakelijk de cultuur onder een Microscoop periodiek inspecteren en verwijderen van de verontreinigingen. Af en toe, moet een nieuwe cultuur worden gestart vanuit een klein aantal cellen handmatig gered uit een verontreinigde cultuur. Dit verhoogt de tijd die nodig is om gezonde Stentor culturen. Ten derde, een eencellige uitbreiden naar een cultuur van 400 mL vereist ten minste één maand omdat Stentor celcyclus 3-5 dagen is. Ten vierde, in tegenstelling tot andere model categorieën, Stentor zelden gaan in de vorm van de cyste en zij kunnen niet worden ingevroren.
Een belangrijk aspect van het kweken van de Stentor is de selectie van een geschikte voedsel organisme. Verschillende methoden voor het kweken van de Stentor werden eerder beschreven. Een van hen stelt voor het gebruik van afgeroomde melk voor cultuur-bacteriën die vervolgens Stentor voeden. Deze techniek is effectief in het kweken van de Stentor; toepassing van genomische technieken vereist echter puur monsters om verwarring als gevolg van genomic leesbewerkingen van ongedefinieerde voedsel organismen te voorkomen. Met behulp van het huidige protocol, Stentor kunnen worden geteeld in massa en omdat hun voedsel, Chlamydomonas, heeft zijn sequenced, de aanwezigheid van genomic verontreiniging van de voedsel-organisme kan worden gedetecteerd en gecontroleerd voor. Om onbekende redenen moest tandsteen vullen zijn voorraden door terug te keren naar waar hij vond Stentor vóór. Met het huidige protocol, heeft men kunnen houden Stentor jarenlang.
Regeneratie experimenten met Stentor zijn over het algemeen eenvoudig, maar er zijn een paar kritische details in gedachten te houden. Met betrekking tot paragraaf 2, snijden Stentor cellen doormidden kunnen worden beheerst in minuten. Beheersen van meer geavanceerde procedures voor microchirurgie van Stentor voorschrijven een week van de praktijk. Terwijl het uitvoeren van een sacharose of ureum behandeling (sectie 3), als aan het begin van de beeldvorming van de meeste cellen nog hun membranellar bands, verhogen incubatietijd door 10-30 s voor wanneer sacharose behandeling wordt vervolgens uitgevoerd. De tijd van sacharose behandeling na 3 min incubatie niet verhogen omdat het leiden celdood tot zal.
Beeldvorming van de Stentor vereist regeneratie methoden naar afbeelding grote cellen gedurende lange perioden van tijd. De beeldvorming methode gedetailleerd beschreven in sectie 4 kan alleen worden gebruikt met een rechtop Microscoop. Als een omgekeerde Microscoop beschikbaar in plaats daarvan is, kunnen vervolgens cellen worden geplaatst op een dia of een dekglaasje aan in kleine kamers. Een methode is het maken van een kamer van vaseline en cover met een dekglaasje aan ter voorkoming van verdamping. Als alternatief, een kamer voor een afzonderlijke cel kan worden gemaakt door een gat met een perforator voor de gewenste grootte in een 1 x 1 cm2 vierkante van silicium spacer (tabel van materialen), de spacer te plaatsen op een dekglaasje aan, waardoor cellen in de zaal , en die betrekking hebben op de kamer met een dekglaasje aan. Wanneer imaging, als Stentor niet in de juiste stand te observeren de meest karakteristieke kenmerken van elke fase van de regeneratie, tikt u op de plaat stevig om het contract van de cel. Bekijk de cel uitbreiden ter identificatie van de fase van de regeneratie (volledig uittrekbaar neemt ongeveer 45 s). Als de cel zich nog steeds in de verkeerde richting, herhaalt u het afluisteren. De beelden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 6 werden genomen door een Microscoop stereo zoom; alle experimenten gedetailleerde, kunnen echter wel worden uitgevoerd met behulp van een 5 X de ontrafeling van de stereomicroscoop.
Een andere uitdaging naast kweken en imaging Stentor is het volgen van regeneratie, specifiek de hoeveelheid tijd die nodig is om de stadia te identificeren. Als de cel regeneratie perfect georiënteerd met de regio van de mondelinge primordium duidelijk zichtbaar is, duurt identificatie van de etappe een paar seconden. De Stentor -cel is echter soms in een oriëntatie die is preventie van duidelijke toewijzing van regeneratie fase, dus meer tijd neemt om te identificeren. De aanzienlijke hoeveelheid benodigde tijd voor fase afzonderlijke regeneratie cellen zou kunnen de kwantificering van alle regeneratie cellen vertragen, dus het verminderen van de temporele precisie van enscenering en de eis dat de waarnemer te wachten en herstellen via een image de cel toe achter het is verhuisd naar een nieuwe oriëntatie. Dit experiment is derhalve zowel tijd en arbeidsintensief. Om deze redenen zou het zeer wenselijk om geautomatiseerde methoden voor het opsporen van de Stentor cellen en stadia van regeneratie in videomicroscopie gegevens toewijzen. Dit zou ook voor meer reproduceerbare experimenten, toename van de grootte van de steekproef en de verwijdering van menselijke bias.
De opkomst van zeer gevoelige genomic en proteomic methoden is begonnen met studies van afzonderlijke cellen in bereik gebracht. Voor dergelijke eencellige analyses maakt de enorme grootte van de cel van een Stentor het een wenselijk proefpersoon voor proof-of-concept experimenten. Voor dergelijke experimenten mogelijk, culturing Stentor is van fundamenteel belang, en dus de hier beschreven methoden een rol moeten spelen in de verdere ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van eencellige.

Cellen zijn geen eenvoudige zakken van enzymen, maar eerder ingewikkelde machines waarvan de onderdelen zijn zorgvuldig geschaald naar het juiste formaat en gerangschikt in welomschreven posities. De morfogenese van afzonderlijke cellen vertegenwoordigt een belangrijke proces in de cel en ontwikkelingsbiologie, maar het moleculaire mechanisme is onbekend1,2. Terwijl sommige gekweekte cellen lijken op vlekjes, kunnen eencellige organismen hebben uiterst gecompliceerd platforms, wordt geïllustreerd door de complexe corticale patronen te zien in de categorieën3,4.
Misschien is het meest extreme voorbeeld van een zeer gestructureerde cel Stentor coeruleus, een gigantische heterotrichous Saw verwant onderzocht en Paramecium. Stentor is 1 mm lang en is bedekt met meer dan 100 longitudinale strepen van blauw pigment afgewisseld met rijen van cilia georganiseerd door parallelle stapels microtubulus linten die de lengte van de gehele cel worden uitgevoerd. De cel is trompet-vorm (Figuur 1), met een membranellar band en een mondelinge apparatuur (OA) op het voorste uiteinde en een holdfast dat de cel hecht aan de ondergrond op zijn achterste einde. Naast de duidelijke anterior-posterior polariteit, de cel ook ziet u een onderscheidende chirale patronen, zodanig dat de afstand tussen Ciliaire rijen geleidelijk toeneemt in een richting van de klok. Dit resulteert in een discontinuïteit waar het smalste rij voldoet aan de breedste rij, en dit gebied van het celoppervlak, bekend als de locus van stripe contrast, kan leiden tot de vorming van de tweede reeks van anterior einde structuren als geënt op een andere cel5, waardoor het formeel gelijk aan Spemann de organisator. Dus, alle belangrijke processen van de ontwikkelingsbiologie hebben hun analogen in de Stentor: axiation, patroonformatie en inductie. In een embryo, deze processen worden gedreven door lot verschillen tussen de verschillende cellen, maar in de Stentor, ze moeten worden gedreven door lot verschillen tussen verschillende regio's binnen een enkele cel. Wat definieert de verschillen tussen de regio's binnen de Stentor is een raadsel.
Als enig deel van de Stentor is afgesneden, kan het ontbrekende stuk van de cel regenereren zodanig dat deze een normale cel in een kwestie van uren. Als een cel is gesneden in de helft, of zelfs in veel kleinere stukken, elk stuk reorganiseert in een cel normaal uitziende, maar kleiner en herstelt de juiste evenredigheid tussen cel deel6,7. Zelfs kleine fragmenten, 1/64th de grootte van de oorspronkelijke cel, kunnen regenereren in een kleine, maar normaal geproportioneerd cel, en vervolgens uitgroeien tot de volledige grootte6. Stentor dus presenteert een unieke gelegenheid om de mechanismen van organel grootte schalen en cel groeiregulatie met chirurgische methoden die gewoonlijk op het niveau van de weefsels of hele organismen toegepast worden te bestuderen.
Een van de eigenschappen van de Stentor waarmee het te genereren uit een breed scala van chirurgische operaties is dat het een interne nodulated macronucleus (Figuur 1) met de ongeveer 50.000 exemplaren van de gehele genoom8bevat. Zolang een cel fragment ten minste één macronuclear knooppunt bevat, heeft het de mogelijkheid om het volledig te regenereren. Een andere eigenschap die ten grondslag liggen aan de StentorRegeneratie vermogen is de wonderbaarlijke wondgenezing mogelijkheid. Hoewel veel celtypen geschikt zijn voor de genezing van hun wonden9, vermag Stentor herstellen uit een buitengewone hoeveelheid lichamelijke verstoringen. Een voorbeeld van de terugwinning van de Stentor van een drastische perturbation, samen met de methoden voor het visualiseren van cytoplasmatische stroming in Stentor10 waren eerder gemeld. Deze methoden toestaan de studie hoe verwonden en de daaropvolgende regeneratie van invloed op de fysieke status van het cytoplasma.
Stentorvan enorme omvang, buitengewone Regeneratie vermogen, en het feit dat het veel van de ontwikkelingstoxiciteit verschijnselen gezien in meercellig embryo's (zoals organisatoren, axiation en patronen) manifesteert zich aangetrokken veel developmental biologen tijdens het begin van de vorige eeuw, met inbegrip van Thomas Hunt Morgan7. Microchirurgische benaderingen aangetoond tijdens de 50 's en 60 's, een verrassende scala van regeneratieve en morfogenetische processen in deze eencellig organisme11. Echter is Stentor ontwikkeld als een modelsysteem moleculaire biologie pas onlangs. Tijdens de afgelopen jaren, het genoom van de Stentor was sequenced en geassembleerd8, en de methode erover genexpressie RNAi via voeding ontwikkelde12was.
Onlangs was een van de redenen dat de Stentor was uitgegroeid tot een modelorganisme voor moderne moleculaire biologie alleen de moeilijkheid van het kweken van de grote culturen te wijten aan haar lange celcyclus (3 tot 5 dagen). Echter, moderne genomic en proteomic methoden vereisen minder materiaal dan ze gewend, en het volume van een eencellige Stentor voldoende voor deze methoden, is zelfs zonder toevlucht te nemen tot ultrasensitive methoden die zijn ontwikkeld voor de analyse van single cellen die veel kleiner dan de Stentor zijn. Sectie 1 van het protocol een overzicht van de procedure voor de vaststelling van een grote cultuur van een enkele cel van de Stentor . Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om een grote cultuur van een fragment van de cel verkregen door het snijden van een cel. Deel 1 bevat ook de richtlijnen voor het behoud van gezonde Stentor culturen gedurende lange perioden van tijd. Afdeling 2 van het protocol voorziet in de methodologie inducerende cel regeneratie door het snijden van de cellen handmatig met een naald van glas. Sectie 3 van het protocol is gewijd aan twee methoden voor het induceren van de regeneratie van specifieke cel structuren (membranellar band en orale apparatus): behandeling van de cellen met sacharose of ureum leidt tot het vergieten van deze structuren, gevolgd door hun regeneratie weer gecontroleerd. Deel 4 van het protocol gegevens een methode voor de beeldvorming van afzonderlijke regeneratie cellen gedurende lange perioden van tijd. Sectie 4 eindigt met de beschrijving van de stadia van regeneratie en tips over de analyse van de dynamiek van de regeneratie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus live culture</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>131598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii on agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>152040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, 1500 cP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>715740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cup glass container with glass lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1095600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureWell silicone sheet material</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher finest</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1379801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes. 
			OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B120-90-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller P-87</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the study of regeneration in stentor

Cellen moeten zitten kundig voor hun delen om te herstellen van externe verstoringen te regenereren. De eencellige Saw Stentor coeruleus is een uitstekende modelorganisme te bestuderen wondgenezing en latere cel regeneratie. De Stentor -genoom werd onlangs, samen met moderne moleculaire biologiemethodes, zoals RNAi beschikbaar. Deze tools maken het mogelijk om te studeren van eencellige regeneratie op moleculair niveau. De eerste sectie van het protocol omvat vaststelling van Stentor celculturen van afzonderlijke cellen of cel fragmenten, samen met de algemene richtsnoeren voor het behoud van de culturen van de Stentor . Stentor kweken in grote hoeveelheden voorziet in het gebruik van waardevolle hulpmiddelen zoals biochemie, sequencing en massaspectrometrie. Latere secties van het protocol betrekking hebben op verschillende benaderingen inducerende regeneratie in de Stentor. Handmatig snijden van cellen met een naald van glas kunt bestuderen van de regeneratie van grote cel delen, terwijl het behandelen van cellen met sacharose of ureum kunt bestuderen van de regeneratie van specifieke structuren gelegen aan het voorste uiteinde van de cel. Een methode voor imaging afzonderlijke regeneratie cellen is voorzien, samen met een rubriek voor enscenering en analyseren van de dynamiek van regeneratie. Het gehele proces van regeneratie is verdeeld in drie fasen. Door het visualiseren van de dynamiek van de progressie van een bevolking van cellen door de stadia, is de heterogeniteit in regeneratie timing aangetoond.

Stentor culturen zijn betrouwbaar opgericht en onderhouden van afzonderlijke cellen of fragmenten van de cel met behulp van sectie 1 van het protocol. Een representatief voorbeeld van een grote gezonde cultuur wordt weergegeven in de Video 1.
Het tijdsverloop van regeneratie werd gemeten in Stentor met de sacharose behandelingsmethode voor het inleiden van de regeneratie beschreven in stap 3.1, gecombineerd met de beeldvorming en de methode van de analyse besproken in hoofdstuk 4 (Figuur 7). Dit perceel geeft aan dat er een één-uur-lange spreiding in de tijd genomen door de bevolking van cellen om het bereiken van een bepaalde fase. Dit soort analyse kan de studie van temporele heterogeniteit in de regeneratie-proces in een bevolking van cellen te regenereren.
Het volgende is een samenvatting van regeneratie timing die tot nu toe heeft waargenomen na tientallen sacharose behandelingen (Figuur 4 en Figuur 6). Fase 1 is wanneer de Stentor cellen eruit teardrops zonder enige band van de membranellar (deze fase start onmiddellijk na sacharose wassen). Deze fase duurt voor 3-6 h. fase 2 is wanneer een band membranellar verschijnt en groeit (3-6 uur na de behandeling van sacharose). Deze fase duurt 3-4 h. fase 3 is wanneer een mondelinge primordium op het achterste uiteinde van de membranellar band (6-8 uur na de behandeling van sucrose verschijnt), en beide structuren worden verplaatst naar de voorste einde van de cel. Deze fase duurt 1-2 h. Wanneer zowel de band van de membranellar en de mondelinge toestellen de anterior einde van de cel bereikt, dit aangegeven de voltooiing van de regeneratie. De cel heeft karakteristieke Stentor trompet-achtige vorm aangenomen. Cellen werden volledig geregenereerde 8-9 h na sacharose behandeling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Figuur 1. Momentopname van de Stentor. De band van de membranellar en de mondelinge toestellen staan anterior eind van de cel. De holdfast is aan het achterste einde van de cel. Stentor macronucleus is nodulated. Een goed gevoed Stentor heeft groene voedsel vacuolen met meestal Chlamydomonas. De bar van de schaal is 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figuur 2. Stentor snijden set-up. Cel snijden wordt uitgevoerd door het handmatig manipuleren van een glas naald tijdens het kijken naar de cel met behulp van een commercieel beschikbare ontleden stereomicroscoop. Het doel van het weefsel papier is zodat de witte achtergrond om te zien de cellen beter. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Figuur 3. Momentopnamen van de Video 3 illustreren hoe te snijden een Stentor met een glas naald. (A) A Stentor onmiddellijk voordat de naald het raakt. (B) een Stentor zachtjes ingeklemd tussen de dia van een naald en glas. (C) A gecontracteerd Stentor reageren op de kracht van de naald. (D) A Stentor ingekrompen door zachtjes te drukken op de cel met de kant van de naald. (E) A Stentor nu doormidden gesneden maar niet gescheiden. (F) twee Stentor fragmenten. De bar van de schaal is 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figuur 4. Schematische visualisatie van deel 3 en deel 4 van het protocol. Dit is een geïllustreerde protocol voor het uitvoeren van sacharose of ureum behandeling en observatie van de cel regeneratie. De tijd die is aangegeven in het onderste paneel wordt gemeten vanaf het begin van the Wash 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figuur 5. De setup voor imaging en/of directe observatie van regeneratie met een rechtop Microscoop. In elke 4 µL druppel opknoping van het dekglaasje aan, is er één cel regeneratie ondergaan. Water in de putten van de plek glasplaat beperkt verdamping van de druppels. Deze setup kan na de regeneratie van meerdere cellen parallel geschakeld. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Figuur 6. Momentopnamen van de Stentor in elke fase van de membranellar band en de mondelinge apparaat regeneratie. (A) fase 1 wordt gekenmerkt door een teardrop-achtige cel vorm en het ontbreken van de membranellar band. (B) Stage 2 is gekenmerkt door het verschijnen van de membranellar band, een cilia gebaseerde structuur die voortdurend verslaat. Membranellar banden zijn gemarkeerd met witte stippellijnen in panelen B - D. (C en D) fase 3 wordt gekenmerkt door de verschijning van orale primordium (gemarkeerd met een pijl). Mondelinge primordium ziet eruit als een invagination op het achterste uiteinde van de band membranellar. De mondelinge primordium zal vervolgens omhoog naar de voorste van de cel tot het mondeling apparaat. (E) regeneratie is voltooid wanneer de cel de karakteristiek Stentor trompet-achtige vorm heeft aangenomen, en de mondelinge apparaten (gemarkeerd met een pijl) heeft verbreed anterior eind van de cel. De bar van de schaal is 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figuur 7. Gestapeld vak perceel weergegeven: hoe de verhoudingen van cellen in alle stadia van regeneratie na sacharose behandeling na verloop van tijd verandert. De plot geeft heterogeniteit in de timing van de regeneratie stadia in een populatie van regeneratie cellen. "Reg. end" geeft aan de voltooiing van de regeneratie. Het aantal cellen: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video 1. Voorbeeld van een gezonde cultuur van de Stentor . In het algemeen, als een cultuur dit geconcentreerd is, splitsing van de cultuur wordt aanbevolen. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Stentor vertragen met methylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Snijden Stentor. Afzonderlijke cellen kunnen handmatig worden gesneden in meerdere stukken onder een stereo microscoop ontleden door te drukken op een glas naald door de cel. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Probleem met cultuur</td>
			<td>Mogelijke oplossing</td>
			<td>Mogelijke preventie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultuur is overweldigd door raderdiertjes of andere grote organismen.</td>
			<td>Verwijder zoveel Stentor mogelijk in een nieuwe cultuur schotel. Daarna wassen de cellen drie keer.</td>
			<td>Stentor grondig wassen bij het ontvangen van hen, zelfs wanneer het kopen van hen van een commerciële leverancier.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultuur is overweldigd door de schimmel of andere kleine organismen.</td>
			<td>Identificeren van een hoek waar zich het minst Stentor. In dat gebied, zo veel media verwijderen als mogelijk is zonder het verwijderen van vele Stentor en voeg in nieuwe PSW. Meng voorzichtig maar grondig te distrubute de binnenvallende organismen. Sla de volgende voederplaats en de Stentor zal opeten.</td>
			<td>Regelmatig observeren van de cultuur en verwijderen van kleine verontreinigingen door media voor verse PSW uit te wisselen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor gelegd bovenop elkaar.</td>
			<td>Splitsen de cultuur, zodat de concentratie minder dan 20 cellen/mL is.</td>
			<td>Culturen vaker splitsen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor cellen zijn paring.</td>
			<td>Voer elke 4 dagen in plaats van elke 5 dagen.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultuur heeft een heleboel donkere afvalmateriaal.</td>
			<td>Verwijder zo veel van het donkere materiaal, Stentor afval, mogelijk zonder de cellen te verwijderen. Als Stentor zijn gekoppeld aan het donkere materiaal, Pipetteer omhoog en omlaag om de release van de Stentor -cellen uit hun afval en vervolgens de media met de afvalstoffen te verwijderen zonder de cellen te verwijderen. Of, verwijder de Stentor en diervoeders dienovereenkomstig minder.</td>
			<td>Feed Stentor 1 mL minder voedsel per 100 mL van de cultuur.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ongezond ogende (vacuolated/opgeblazen of afgeronde) Stentor.
</td>
			<td>Verwijder zo veel media mogelijk zonder veel Stentor cellen verwijderen en toevoegen van nieuwe PSW.</td>
			<td>De media regelmatig wisselen.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Probleemoplossing voor het kweken van de Stentor.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden voor de studie van regeneratie in de Stentor

De reus Ciliophora, Stentor coeruleus, is een uitstekend systeem voor studeren regeneratie en wondgenezing. We presenteren procedures voor de vaststelling van de Stentor celculturen van afzonderlijke cellen of cel fragmenten, inducerende regeneratie door snijden cellen, chemisch inducerende de regeneratie van de membranellar band en mondelinge toestellen, imaging en analyse van cel regeneratie weer gecontroleerd.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducerende Compleet Poliep Regeneration van de aboral Physa van de Starlet Zeeanemoon<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolatie van Mouse Endometrial epitheliale en stromale cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualisatie

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...