Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH R01 GM113602 (WFM) ואת ה-NSF 1144247 (אי אל). אנו להכיר מארק Slabodnick, נטלי קירקלנד לפיתוח הגירסאות הראשונית של כמה מהפרוטוקולים האלה, לדיונים אינפורמטיבי. אנו מודים קארינה Perlaza ולואיס גריסון על קריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Culturing Stentor מציג מספר אתגרים. ראשית, כדי לבצע ניסויים הדורשים מספר גדול של תאים, אחד צריך לשמור על מספר רב של תרבויות Stentor , כמו תרבויות להיות לא בריא כאשר ריכוז Stentor עולה 20 תאים למ"ל. שנית, המיקרואורגניזמים יכול לזהם Stentor תרבויות קרובות לחלק מהר יותר Stentor , להציף את התרבות (מזהם נפוץ הוא rotifers). לפיכך, יש צורך לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ מעת לעת ולהסיר את המזהמים. לעיתים, תרבות חדשה צריכה להיות החל ממספר קטן של תאים ניצלה באופן ידני מתרבות מזוהמים. פעולה זו מגדילה את הזמן הנדרש כדי לשמור על תרבויות Stentor בריאים. שלישית, הרחבת תא בודד לתוך תרבות 400 מ ל דורש לפחות חודש אחד, כי מחזור התא Stentor הוא 3-5 ימים. רביעית, בניגוד מודל אחר ciliates, Stentor לעיתים רחוקות ללכת לתוך ציסטה טופס, הם לא יכולים להיות קפוא.
היבט חשוב של culturing Stentor הוא הבחירה של אורגניזם מזון המתאים. שיטות שונות עבור culturing Stentor שתוארו קודם לכן. אחד מהם מציע להשתמש חלב רזה התרבות חיידקים אשר מאכילים Stentor. כזה טכניקה יעילה culturing Stentor; עם זאת, יישום של טכניקות גנומית דורש דוגמאות טהור כדי למנוע בלבול הנובע קריאות גנומית של אורגניזמים מזון לא מוגדר. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, ניתן לגדל Stentor במסה, כי את האוכל שלהם, Chlamydomonas, יש כבר וסודרו, הנוכחות של זיהום גנומית של האורגניזם המזון ועוזרת מבוקר על. מסיבות לא ידועות, טרטר נאלץ לחדש את המלאי שלו על-ידי החזרת עד היכן הוא מצא Stentor לפני. עם הפרוטוקול הנוכחי, הצלחנו לשמור על Stentor במשך שנים.
התחדשות ניסויים עם Stentor הם בדרך כלל פשוטה, אבל יש כמה פרטים קריטיים שכדאי לזכור. לגבי סעיף 2, חיתוך Stentor תאים לחצי יכול להיות מומחה תוך דקות. מאסטרינג כירורגיים מתקדמים יותר של Stentor עשויים לדרוש שבוע של תרגול. בזמן ביצוע טיפול סוכרוז או אוריאה (סעיף 3), אם בתחילת הדמיה רוב התאים עדיין יש להקות membranellar שלהם, להגביר את זמן הדגירה על ידי 10-30 s עבור מתי סוכרוז הטיפול מבוצע הבא. לא להאריך את זמן הטיפול סוכרוז מעבר 3 דקות הדגירה מכיוון שהתוצאה תהיה מוות של תאים.
הדמיה של Stentor התחדשות דורש שיטות לתאים גדולים התמונה לאורך פרקי זמן ארוכים. שיטת הדמיה מפורטת בסעיף 4 יכול לשמש רק עם מיקרוסקופ זקוף. אם במיקרוסקופ הפוכה זמין במקום, ואז התאים ניתן להניח בשקופית או coverslip בתאי קטן. שיטה אחת היא ליצור תא מחוץ וזלין ולכסות עם coverslip אחר כדי למנוע אידוי. לחלופין, תא עבור תא בודד יכול להתבצע על ידי עושה חור עם אגרופים חור בגודל הרצוי 1 x 1 ס מ2 מרובע של סיליקון מרווח (טבלה של חומרים), הצבת את מרווח coverslip, שם תאים בבית הבליעה , מכסה את התא עם coverslip אחרת. כאשר הדמיה, אם Stentor אינם לכיוון הנכון כדי לבחון את התכונות האופייניות של כל שלב של התחדשות, הקש על לוח בחוזקה כדי להפוך את החוזה תא. לצפות את התא להרחיב כדי לזהות את השלב של התחדשות (למיתוח לוקח בערך 45 s). אם התא נמצא עדיין הכיוון הלא נכון, חזור הנקישות. הדימויים המוצגים באיור 1 , איור 6 צולמו על ידי מיקרוסקופ זום סטריאו; עם זאת, כל הניסויים מפורט ניתן לבצע באמצעות 5 X לנתח סטריאו מיקרוסקופ.
אתגר נוסף מלבד culturing והדמיה Stentor הוא המעקב של התחדשות, במיוחד את כמות הזמן הדרוש כדי לזהות בשלבים. אם התא ההתחדשות מכוון בצורה מושלמת עם האזור של ראשית הפה נראה בבירור, זיהוי של הבמה לוקח כמה שניות. לפעמים, אולם, התא Stentor היא בכיוון מניעת הקצאה ברורות של שלב התחדשות, ובכך לקחת יותר זמן כדי לזהות. משך הזמן הנדרש כדי שלב ההתחדשות תאים בודדים עשוי לעכב את כימות של כל התאים ההתחדשות, ובכך להקטין את הדיוק הטמפורלי של היערכות ודרישה המתבונן לחכות, להתקין מחדש התא אחריו עברה משמעותית כיוון חדש. כתוצאה מכך, הניסוי הזה הוא גם זמן וגם עבודה אינטנסיבית. מסיבות אלו, רצוי מאוד לפתח בשיטות אוטומטיות עבור Stentor התאים ולהתאושש הקצאת בשלבים של התחדשות בנתוני מיקרוסקופ וידאו. אלה יאפשרו גם לניסויים לשחזור יותר, מגדילה גודל המדגם, הסרת הטיה אנושית.
הופעתה של שיטות רגישה מאוד גנומית פרוטיאומיה מבנית החלה להכניס יד מחקרים של תאים בודדים. עבור ניתוחים תא בודד כזה, בגודל ענק של תא Stentor הופך נושא הבדיקה רצוי עבור ניסויים הוכחה הרעיון. לניסויים כזה בלתי אפשרי, culturing Stentor הוא מהותי, אז בשיטות המתוארות כאן צריך לשחק תפקיד להמשך פיתוח של טכניקות מתקדמות יותר מתא בודד.

התאים אינם תיקים פשוטים של אנזימים, אבל מאוד מורכבת למדי מכונות שהרכיבים בקפידה לשינוי הגודל הנכון, לארגן תפקידים מוגדרים היטב. מורפוגנזה של תאים בודדים מייצג תהליך מפתח התא וביולוגיה התפתחותית, אך המנגנון המולקולרי שלה לא ידוע1,2. בעוד כמה תאים בתרבית דומות כתמים, אורגניזמים חד־תאיות יכול מאוד סיבכו ארכיטקטורות, ומעוררות את דפוסי בקליפת המוח מורכבת ראיתי3,ciliates4.
אולי הדוגמה הקיצונית ביותר של תא מאוד מובנית הוא Stentor coeruleus, heterotrichous ענק ciliate קשור Tetrahymena ו- סנדלית. Stentor הוא באורך של 1 מ מ, והוא מכוסה עם יותר מ-100 פסים אורכיים של פיגמנט כחול לסירוגין עם שורות של cilia מאורגנים בערימות מקבילים של סרטים microtubule להפעיל את משך כל התא. התא הוא חצוצרה בצורת (איור 1), עם תזמורת membranellar מכשירים דרך הפה (OA) לסיומה הקדמי, ואת holdfast שמתחבר התא המצע בקצה האחורי שלו. בנוסף הקוטביות ברור הקדמי, האחורי, התא גם מראה המתבנת כיראלי, ייחודי כך ריווח בין שורות ciliary בהדרגה גדל עם כיוון השעון. התוצאה רציפות שם השורה הצר פוגש את השורה הרחב ביותר, ואת אזור זה של פני השטח של התא, המכונה מיקומה של פס ניגודיות, יכולים לגרום להיווצרות הסט השני של מבנים הקצה הקדמי כאשר הושתל אל תא אחר5, . עושה את זה באופן רשמי המקביל לסדרן של Spemann. לפיכך, כל תהליכי מפתח ביולוגיה התפתחותית יש תחליפי שלהם ב- Stentor: axiation, תבניות ו אינדוקציה. העובר, תהליכים אלה מונעים על ידי הגורל ההבדלים בין תאים שונים, אבל ב- Stentor, הם חייבים להיות מונע על ידי הגורל הבדלים בין אזורים שונים בתוך תא בודד. מה שמגדיר את ההבדלים בין האזורים בתוך Stentor היא בגדר תעלומה.
אם חלק כלשהו של Stentor נחתך, החתיכה החסרה של התא יכול להתחדש להניב תאים נורמליים תוך מספר שעות. אם תא לחתוך לחצי, או אפילו לחלקים קטנים הרבה יותר, כל קטע מארגנת מחדש ויהיו לתוך תא שנראה נורמלי אבל קטנים יותר ומשחזרת את המידתיות נכונה בין תא חלקים6,7. אפילו שברירי, 1/64th לגודל התא המקורי, מסוגלים להתחדש בתוך תא קטן, אך בדרך כלל פרופורציות ולאחר מכן לגדול בגודל מלא6. Stentor ובכך מציגה הזדמנות ייחודית ללמוד את המנגנונים של אברון גודל שינוי גודל של תאים צמיחה תקנה בשיטות כירורגיות המוחלות בדרך כלל ברמה של רקמות או אורגניזם שלם.
אחד המאפיינים של Stentor ומאפשרת לו להתחדש מתוך מגוון רחב של ניתוחים כירורגיים הוא שהוא מכיל macronucleus nodulated יחיד (איור 1) עם בערך 50,000 עותקים של כל הגנים8. כל עוד קטע התא מכילה צומת macronuclear אחד לפחות, הוא בעל יכולת להתחדש באופן מלא. מאפיין נוסף המשמש כבסיס יכולת התחדשות של Stentor, היא יכולתה ריפוי פצע עצום. סוגי תאים רבים אמנם מסוגל ריפוי הפצעים שלהם9, Stentor הוא מסוגל להתאושש במגוון יוצא דופן של לפליטת הפיזי. דוגמה Stentor ההתאוששות מן ההפרעות דרסטית, יחד עם השיטות להמחשת זרימה cytoplasmic Stentor10 דווחו בעבר. שיטות אלה מאפשרות לימוד משפיעים על התחדשות איך ופצעו ובעקבות המצב הפיסי של הציטופלסמה.
גודל עצום של stentor, יכולת התחדשות יוצאת דופן, והעובדה כי זה בא לידי ביטוי, תופעות התפתחותיות אצל העוברים multicellular (כגון המארגנים, axiation והמתבנת) רבות נמשך ביולוגים התפתחותיים רבים במהלך הפנייה של המאה הקודמת, לרבות תומאס הנט מורגן7. במהלך החמישים והשישים, גישות המיקרוכירורגית הדגים מערך מדהים של תהליכים morphogenetic ולעירור החד-תאי הזה11. עם זאת, Stentor פותחה כמערכת מודל בביולוגיה מולקולרית רק לאחרונה. במהלך השנים האחרונות, הגנום של Stentor היה וסודרו והתכנסו8, ואת השיטה perturb ביטוי גנים באמצעות RNAi מאכילים היה מפותח12.
אחת הסיבות Stentor פותחה לתוך אורגניזם מודל הביולוגיה המולקולרית המודרנית רק לאחרונה היה הקושי של גידול גדול התרבויות בגלל מחזור התא ארוכה שלה (3 עד 5 ימים). עם זאת, שיטות מודרניות גנומית פרוטיאומיה מבנית לדרוש פחות חומר מאשר הם נהגו, הנפח של תא בודד Stentor היא מספקת שיטות אלה, אפילו בלי להזדקק העדינה שיטות שפותחו עבור הניתוח של יחיד תאים קטנים בהרבה Stentor. בסעיף 1 של הפרוטוקול מפרט את ההליך עבור יצירת תרבות גדול מתא Stentor בודד. אותה גישה יכול לשמש כדי ליצור תרבות גדול מרסיס תא שהושג על ידי חיתוך תא. בסעיף 1 מספק גם ההנחיות לשמירה על תרבויות Stentor בריאים לאורך פרקי זמן ארוכים. סעיף 2 של הפרוטוקול מספקת את המתודולוגיה להשראת התחדשות התאים על ידי גזירה את התאים באופן ידני עם מחט זכוכית. סעיף 3 של הפרוטוקול מוקדש שתי שיטות של גרימת לרגנרציה של תא מסוים מבנים (membranellar band ואוראלי-המנגנון): טיפול תאי עם סוכרוז או אוריאה שמוביל שפיכת של מבנים אלה, ואחריו שלהם התחדשות. סעיף 4 של הפרוטוקול פירוט שיטת ההדמיה של תאים בודדים ההתחדשות במשך פרקי זמן ארוכים. סעיף 4 מסתיים התיאור של השלבים של התחדשות וטיפים על הניתוח של התחדשות דינמיקה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus live culture</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>131598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii on agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>152040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, 1500 cP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>715740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cup glass container with glass lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1095600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureWell silicone sheet material</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher finest</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1379801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes. 
			OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B120-90-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller P-87</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the study of regeneration in stentor

התאים צריכים להיות מסוגלים לחדש את החלקים שלהם להתאושש לפליטת חיצוניים. Ciliate חד־תאיות Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע התחדשות התאים הבאים. הגנום Stentor הפכו לזמינות לאחרונה, יחד עם שיטות בביולוגיה מולקולרית מודרניים, כגון RNAi. כלים אלה מאפשרים ללמוד תא בודד התחדשות ברמה המולקולרית. המקטע הראשון של הפרוטוקול מכסה הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, ביחד עם הנחיות כלליות לשמירה על תרבויות Stentor . Culturing Stentor בכמויות גדולות מאפשרת שימוש בכלים יקר כמו ביוכימיה, רצף ספקטרומטר מסה. המקטעים הבאים של הפרוטוקול לכסות גישות שונות כדי גרימת התחדשות ב- Stentor. חיתוך באופן ידני תאים עם מחט זכוכית מאפשרת ללמוד לרגנרציה של חלקי תאים גדולים, כאשר מתייחסים תאים עם סוכרוז או אוריאה מאפשר ללמוד לרגנרציה של מבנים ספציפיים ממוקם בקצה הקדמי של התא. שיטת הדמיה תאים בודדים ההתחדשות מסופק, יחד עם טבלת עזר להערכת הישגים היערכות וניתוח את הדינמיקה של התחדשות. התהליך כולו של התחדשות מחולק בשלושה שלבים. דמיין את הדינמיקה של ההתקדמות של אוכלוסיה של תאים דרך השלבים, הוא הפגין את הטרוגניות בתזמון התחדשות.

Stentor תרבויות אמינה שהוקמו והותאמו מתוחזק תאים בודדים או שברי תאים באמצעות בסעיף 1 של הפרוטוקול. דוגמה מייצגת של תרבות בריא גדול מוצג 1 וידאו.
הקורס זמן של התחדשות נמדדה ב Stentor באמצעות שיטת טיפול סוכרוז לאתחול של התחדשות המתוארים שלב 3.1, בשילוב עם הדמיה ושיטת ניתוח שנדונו בסעיף 4 (איור 7). מגרש זה מציין כי כפולה אחת באורך שעה מהזמן נלקח על ידי אוכלוסיית תאים כדי להגיע בכל שלב מסוים. סוג זה של ניתוח מאפשר חקר הטרוגניות טמפורלית בתהליך התחדשות אוכלוסיה של התחדשות תאים.
לפניכם סיכום של תזמון התחדשות זה נצפתה עד כה לאחר עשרות טיפולים סוכרוז (איור 4 , איור 6). שלב ראשון הוא כאשר התאים Stentor נראים כמו דמעות בלי שום להקה membranellar (בשלב זה מתחיל מיד לאחר שטיפה סוכרוז). שלב זה נמשך 3-6 ח' שלב 2 הוא כאשר מופיעה להקה membranellar גדל (3-6 שעות לאחר הטיפול סוכרוז). שלב זה נמשך 3-4 ח' בשלב 3 הוא כאשר ראשית דרך הפה מופיע בקצה האחורי של הלהקה membranellar (6-8 שעות לאחר הטיפול סוכרוז), שני מבנים מועברים לקראת סוף התא הקדמי. שלב זה נמשך 1-2 h. הלהקה membranellar והן את המנגנון אוראלי הגיע לקצה הקדמי של התא, זה הצביעו על השלמתו של התחדשות. התא אימצה צורה אופיינית בחצוצרה Stentor . התאים היו לגמרי מחדש 8-9 שעות לאחר הטיפול סוכרוז.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> איור 1. תמונת מצב של Stentor. הלהקה membranellar את המנגנון אוראלי מוצגים בקצה הקדמי של התא. Holdfast נמצאת בקצה האחורי של התא. Stentor macronucleus הוא nodulated. מוזן היטב Stentor יש ירוק וקואלות מזון המכיל בעיקר Chlamydomonas. סולם בר הוא 0.5 מ מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> באיור 2. הגדרת חיתוך stentor . תא חיתוך מתבצע על ידי באופן ידני מניפולציה מחט זכוכית בזמן שאני מסתכל על התא באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ויבתר זמינים מסחרית. מטרת העיתון רקמות היא לספק הרקע הלבן כדי לראות את התאים יותר טוב. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> איור 3. תמונות של 3 וידאו המדגימה כיצד לחתוך את Stentor עם מחט זכוכית- (א) א Stentor מיד לפני זה נוגע המחט. (B) A Stentor סחוט בעדינות בין שקופית מחט וזכוכית. (ג) א מתכווץ Stentor מגיב בכוח המחט. (ד) A Stentor שהוא נחתך על ידי בעדינות לחיצה על התא עם הצד של המחט. (E) A Stentor עכשיו לחתוך לשניים אבל לא מופרדים. (F) שני קטעים Stentor . סולם בר הוא 0.25 מ"מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> באיור 4. ויזואליזציה סכמטי של סעיף 3, סעיף 4 של הפרוטוקול. זהו פרוטוקול מאויר לביצוע סוכרוז או אוריאה טיפול והתבוננות של התחדשות התאים. הזמן שצוין בחלונית התחתונה נמדד מתחילת לשטוף את 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> איור 5. הגדרת להשגחה הדמיה ו/או ישיר של התחדשות עם מיקרוסקופ זקוף. רביב כל-µL 4 תלוי coverslip, יש תא אחד בתהליך התחדשות. מים הבארות של לוח הזכוכית ספוט מגביל אידוי טיפות. התקנה זו מאפשרת בעקבות ההתחדשות של תאים מרובים במקביל. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> איור 6. תמונות של Stentor בכל שלב ושלב של הלהקה membranellar והתחדשות המנגנון אוראלי. (א) שלב ראשון מאופיין על-ידי צורה דמוית דמעה תא ואת העדר הלהקה membranellar. (B) שלב 2 מתאפיינת במראה של הלהקה membranellar, מבנה מבוסס-cilia שמרביץ ללא הרף. להקות Membranellar מסומנים באמצעות קווים מקווקווים לבן פאנלים B - ד (C ו- D) שלב 3 מתאפיינת במראה של ראשית דרך הפה (מסומן בחץ). ראשית דרך הפה נראה כמו invagination בקצה האחורי של הלהקה membranellar. ראשית דרך הפה ואז לעלות כלפי החלק הפנימי של התא להפוך המנגנון אוראלי. התחדשות (E) הושלמה כאשר התא אימצה האופיינית Stentor חצוצרה צורה, המנגנון אוראלי (מסומן בחץ) הרחיב בקצה הקדמי של התא. סולם בר הוא 0.25 מ"מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> איור 7. מוערמים תיבת מגרש מראה איך הפרופורציות של תאים בכל שלבי חידוש לאחר טיפול סוכרוז את השינויים לאורך זמן. העלילה מציגה הטרוגניות בתזמון של התחדשות שלבים בתוך אוכלוסייה של תאים ההתחדשות. "רג סיום" מצביע על השלמתו של התחדשות. מספר התאים: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> וידאו 1. דוגמה של תרבות Stentor בריא. באופן כללי, אם תרבות זה מרוכז, פיצול התרבות מומלץ. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> וידאו 2. מאט Stentor עם methylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> וידאו 3. חיתוך Stentor. תאים בודדים ניתן לחתוך באופן ידני לחלקים מרובים תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ על ידי לחיצה על מחט זכוכית דרך התא. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בעיה עם תרבות</td>
			<td>פתרון אפשרי</td>
			<td>מניעה אפשרי</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות היא מוצפת rotifers או אורגניזמים גדולים אחרים.</td>
			<td>להסיר כמה שיותר Stentor ככל האפשר לתוך תבשיל תרבות חדשה. לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים.</td>
			<td>לשטוף ביסודיות Stentor בעת קבלת אותם, אפילו בעת רכישת אותם מן הספק מסחרי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות היא מוצפת פטריה או אורגניזמים קטנים אחרים.</td>
			<td>לזהות לפינה שם יש לפחות Stentor. באזור הזה, להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר רבים Stentor ולהוסיף ב PSW חדש. מערבבים בעדינות אך ביסודיות כדי distrubute אורגניזמים הפולשים. דלג על ההזנה הבא, Stentor יאכלו אותם.</td>
			<td>לבחון את התרבות באופן קבוע ולהסיר לכלוך קטן על ידי החלפת מדיה עבור PSW טריים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor שוכבים אחד על השני.</td>
			<td>לפצל את התרבות הריכוז הוא תאים למ"ל פחות מ-20.</td>
			<td>פיצול תרבויות לעתים קרובות יותר.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor תאים ההזדווגות.</td>
			<td>להאכיל מדי 4 ימים במקום כל 5 ימים.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות יש הרבה חומר פסולת כהה.</td>
			<td>הסר כל כך הרבה של החומר האפל, Stentor פסולת ככל האפשר מבלי להסיר את התאים. אם Stentor מחוברים לחומר האפל, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים Stentor מפסולת שלהם ולאחר מכן להסיר את התקשורת עם הפסולת מבלי להסיר את התאים. או, להסיר את Stentor ולהאכיל בהתאם פחות.</td>
			<td>הזנה Stentor 1 מ"ל פחות מזון לכל 100 מ של תרבות.</td>
		</tr>
<tr>
<td>למראה בריא (vacuolated/נפוח או מעוגל) Stentor.
</td>
			<td>להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר תאים Stentor רבים ולהוסיף PSW חדש.</td>
			<td>חילופי המדיה באופן קבוע.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. מדריך לפתרון בעיות עבור culturing Stentor.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Ciliate ענק, Stentor coeruleus, היא מערכת מצויינת ללמוד התחדשות ואף ריפוי פצעים. אנו מציגים את הליכי הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, גרימת התחדשות על ידי חיתוך תאים, מבחינה כימית גרימת לרגנרציה של להקת membranellar, המנגנון אוראלי, הדמיה, וניתוח של תא התחדשות.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...