Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

우리 앤 Dodson 감사와 스테파니 하인리히 smFISH 프로토콜을 최적화 하는 방법에 대 한 조언 위한 Xavier Darzacq 분석 플랫폼, Haiyan 황 통계 분석에 대 한 제안에 대 한 도움말. 이 작품은 십 센트의 3 월 (5-FY15-99), 퓨 자선 트러스트 (00027344), Damon Runyon 암 연구 재단 (35-15) 및 글렌 EÜ을 재단과 NSF 대학원 연구 장학금 부여 번호에서 자금에 의해 지원 되었다 JC에 DGE-1106400입니다.

참고: 모든 버퍼와이 프로토콜에 사용 된 미디어는 표 1에 나열 됩니다. 시 약에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
일 1/1-2 일:
참고: 식물 문화에 대 한 OD600 0.4에 0.6 선호 매체에서의 세포를 성장 한다. Meiotic 문화에 대 한 셀 (일반적으로 1.85의 OD600 에 경작) 기본 메서드를 사용 하 여 감수 분열을 유도.
1. 샘플 고정 및 소화
<ol><li>3% 포름알데히드에 셀의 ~3.5 OD600 의 총 수정.<ol>
<li>식물 문화에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 37% 포름알데히드의 480 µ L를 문화의 5.52 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Meiotic 문화, 문화의 1840 µ L 2 mL microcentrifuge 튜브에 37% 포름알데히드의 160 µ L를 추가 합니다. 하 ~ 5 번 반전 혼합. 주의: 포름알데히드는 독성이 있다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 롤러 드럼에 튜브를 놓습니다. Meiotic 샘플, 20 분 동안 실내 온도에 고정 후 하룻밤 4 ˚C에서 수정 계속, 회전. 참고: 야간 고정 meiotic 샘플 획득 smFISH 데이터의 품질과 재현성을 증가 시킵니다. 고정 시간을 최적화 합니다.</li>
	<li>샘플을 수정 하는 동안 200mm Vanadyl Ribonucleoside 복합물 (VRC) 적어도 10 분 동안 65 ˚C에서 해 동.</li>
	<li>15 mL 튜브에 소화 마스터 믹스 준비: 버퍼 b 425 µ L 200 mm (65 ˚C 하 예 열); VRC 40 µ L 믹스 1 샘플 5 샘플에 대 한 버퍼 B의 2125 µ L 200 m (65 ˚C 하 예 열) VRC m의 200 µ L 믹스. 완전히 밝은 갈색 녹색 VRC 추가 후 표시 됩니다 마스터 믹스에 추가 하기 전에 VRC resuspend을 소용돌이 ~ 5 s. 참고: 추가 VRC 소화 하는 동안 향상 됩니다 smFISH 결과의 일관성 잠재적으로 원유 추출에서 순화 zymolyase 혼합물에 의해 도입 된 nuclease 오염 억제. 이 단계에서 필요한 VRC 양의 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>식물 샘플에 대 일 분 ~ 1057 x g에서 튜브 원심. (후에 야간 고정) meiotic 샘플, 1.5 분 Decant 21000 x g에서 원심 또는 포름알데히드 폐기물 상쾌한 발음. 참고: 모든 원심 분리 단계는 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	<li>아래로 pipetting 또는 튜브를 거꾸로 하 고 혼합 flicking 셀 1.5 mL 찬 버퍼 b에 resuspend. 물의 resuspension 후 2 mL 튜브에 식물 샘플을 전송.</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>1.5 mL 찬 버퍼 b에 셀 resuspend</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>Resuspend 셀 1.5 분 Aspirate에 대 한 21000 x g에서 차가운 버퍼 B. 분리기의 1.5 mL에 완전히 진공 또는 pipetting 액체.</li>
	<li>소화 마스터 믹스, 그리고 짧게 resuspend를 소용돌이의 425 µ L 셀 resuspend 각 튜브를 100T 10 mg/mL zymolyase의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 소용돌이 관에 추가 하기 전에 때마다 zymolyase Zymolyase 각 튜브를 개별적으로 추가할 마스터 믹스에 추가 하는 대신. 두 단계 zymolyase 신속 하 게 침전 물 때문에 튜브 중 소화 일관성을 유지 도움이.</li>
	<li>믹스와 2-3 동 s입니다. 롤러 드럼에 튜브를 놓고 30 ˚C 15-30 분에 소화 합니다. 식물 세포와 초기 meiotic 단계, 보통 ~ 15 분 걸립니다 그리고 meiotic 의향 및 meiotic 사단, 보통 ~ 30 분 걸립니다. 참고: 15 분 후 현미경에 매 5 분을 확인 하 고 세포의 ~ 80% 비-투명 하 고 비 굴절 나타나면 소화를 중지. 가이 시점에서 세포는 매우 깨지기 쉬운. 셀을 부드럽게 처리 하 고 진공 포부 또는 vortexing를 사용 하지 마십시오.
</li>
	<li>원심 ~ 376 x g 3 분 제거에서 튜브 액체 완전히 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 버퍼 B의 1 mL로 세포를 1-2 번 아래로 pipetting으로 resuspend 혼합.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 버퍼 B 액체에 튜브를 원심. 부드럽게 70% 에탄올 (RNase 무료 물과 함께 희석) 1 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>3.5-4 시간 동안 실 온에서 품 어.</li>
</ol>2입니다. 교 잡
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고 (50 mL 약 수에 대 한 걸리는 ~ 30 분 물 목욕에서). 참고: 병 formamide의 산화 방지를 위해 상 온에 도달할 때까지 formamide 병을 열지 마십시오. 주의: Formamide은 독성이 있습니다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 500 µ L의 70% 에탄올에 튜브를 원심. 부드럽게 피펫으로 아래로 나머지 셀 resuspend를 다음 낮은 접착 튜브 셀을 전송. 참고: 다음 세척 시 셀 손실 감소 크게 낮은 접착 튜브를 사용 하 여.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거에서 다시 튜브 모든 에탄올을 원심.</li>
	<li>추가 10 %formamide 워시 버퍼, 그리고 부드럽게 피펫으로의 1 mL를 위아래로 2-3 시간 하 셀 resuspend.</li>
	<li>하이브리드 솔루션을 준비 하는 동안 ~ 20 분 동안 실내 온도에 앉아 셀 수 있습니다. 1 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 50 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 5 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 1 µ L를 혼합. 5 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 250 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 25 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 5 µ L를 혼합.<ol>
<li>Formamide 산화를 방지 하기 위해 튜브를 열기 전에 실내 온도 (-20 ˚C에서 냉동) 교 잡 버퍼를 녹여.</li>
		<li>200mm VRC, 프로브를 추가 하기 전에 5-10 s에 대 한 소용돌이 추가한 후에 설계 상업적으로, 구입 그리고 제조업체의 지침에 따라 재구성.</li>
		<li>2 프로브 공동 incubated 있다면, 추가 1시 10분의 1 µ L 프로브 #1 주식으로 1시 10분의 1 µ L의 희석의 최종 희석 수 있도록 프로브 #2 주식의 희석 ~ 어느 프로브에 대 한 1: 500. 최상의 신호 대 잡음 비율 요구에 필요한 농도 최적화 (자세한 내용은 토론 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>각 튜브를 교 잡 솔루션의 적어도 50 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 적어도 16 시간 동안 롤러 드럼에 30 ˚C에서 품 어.</li>
</ol>주 2/3 일
3. 세척 및 이미징
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼 (FWB)를 준비 합니다.</li>
	<li>롤러 드럼에서 튜브를 제거 하 고 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일 커버 상자에 그들을 배치.</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 위아래로 pipetting으로 10 %FWB 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>3 분 pipetting, 상쾌한 유해 폐기물을 제거에 대 한 샘플 ~ 376 x g에서 원심 고 ~ 50 µ L를 둡니다.</li>
	<li>한편, 15 mL 원뿔 튜브에 DAPI/FWB 준비: 1 샘플, 5 mg/ml DAPI 1 µ L 1000 µ L 10 %formamide 워시 버퍼의 혼합. 10 샘플, 5 mg/ml DAPI 10 µ L로 10 %formamide 워시 버퍼의 10 mL를 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 DAPI/FWB의 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>안티 표 백제 시 약 얼음에 녹여</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 완전히 pipetting으로. 필요한 경우, 모두는 상쾌한 제거 하려면 다시 원심.</li>
	<li>즉시 이미지는 샘플에 대 한 GLOX 버퍼 없이 효소의 50 µ L에 펠 릿을 resuspend. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 3-4 회를 섞어.<ol>
<li>모든 unimaged 샘플 호 적용 상자에서 4 ˚C에까지 계속 준비 이미지. 이미지를 준비, 2 분 ~ 376 x g에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 완전히 제거 하는 방법. 아래와 같은 효소 GLOX에 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플에 대 한 즉시, 몇 군데 되 고 효소 GLOX 버퍼의 15-20 µ L을 추가 합니다. 부드럽게 피펫으로 위아래를 섞어입니다. 참고: 볼륨 추가 셀 펠 릿의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 효소 GLOX 버퍼의 15 µ L에 펠 릿을 resuspending 하는 것을 권장 하 고 현미경에 셀 밀도 확인 합니다. 세포는 너무 조밀한 (세포 서로 응집), 효소 추가 GLOX 버퍼를 추가 합니다. 셀 너무 스파스 있다면, 원심 샘플 하 고 버퍼의 ~ 5 µ L을 제거 합니다.</li>
	<li>피펫으로 5 µ L coverslip (18 m m x 18 m m, 제 1 호), 그리고 넣어 슬라이드에 coverslip에.</li>
	<li>넣어 슬라이드 위에 실험실 지우기는 coverslip 배치 됩니다. 부드럽게 슬라이드 (액체는 coverslip의 모든 4 개의 가장자리에서 빼야 보아야 한다)를 설정 하는 실험실 지우기에 누릅니다.</li>
	<li>알루미늄 호 일에 의해 포함 하는 상자에 현미경을 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	<li>이미지 와이드 필드 형광 현미경을 사용 하 여 높은 확대 (60-100 X)와 높은 수 가늠 구멍. 참고: smFISH 프로브에 의해 방출 되는 광자의 최대 수를 수집, confocal 현미경 권장 하지 않습니다, 그들은 크게 수집 빛의 양을 제한으로. 여기, 데이터 수집 했다 100 X, 1.4 나 목표를 갖춘 현미경에 CY5 필터를 사용 하 여 (EX632/22, EM679/34) 1.3에서 몇 군데 s, 100 %T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 %T; 그리고 DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32%-50 %t. 밝은 필드 참조 이미지 또한 취득 한다. 0.1-0.2의 스텝 크기와 15-25 조각 취득 µ m에서 전적으로 전적으로 위, 보기의 필드의 초점 아래 있도록 그의 모든 RNA 명소는 차지 했다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>물고기-양의17 , StarSearch2, 등 게시 된 smFISH 분석 도구 또는 실험의 정확한 요구 사항에 따라 맞춤 프로그램, smFISH 데이터를 분석 합니다. 참고: 좋은 분석 파이프라인 진정한 RNA 명소는 배경에서 분리 하 고 X, Y 및 Z (옵션) 좌표와 각 자리, 각 셀에 관광 명소의 수의 강도 등의 통계를 출력 하는 임계값을 확인 하려면 사용자를 허용 해야 합니다. 그리고 아마도 거짓 탐지를 필터링 하는 방법으로 매개 변수를 피팅.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 충돌의 관심 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 다른 게시 된 smFISH 프로토콜2,3,21,,2223에서 파생 되 고 효 모 스트레인 배경 SK1 최적화입니다. 최적화 된 매개 변수 셀 번호, 고정 기간, 원심 분리 속도 기간, 소화 기간, 소화 버퍼, 프로브 농도 및 교 잡 버퍼 포함. 교 잡 온도 기간 같은 다른 매개 변수 최적화 하지 했다. 이 섹션에서 우리는이 프로토콜 어떤 효 모 스트레인 배경 및 관심사의 성장 조건에 적응 하는 데 도움이 될 몇 가지 메모를 공유.
싹 트는 효 모의 세포 벽은 프로브 삽입을 방지 하는 세포 벽 때문에 싹 트는 효 모에 높은-품질 smFISH 이미지를 획득 하는 것에 대 한 하나의 주요 도전 이다. Zymolyase에 의해 세포 벽의 불완전 한 소화는 프로브와 신호에 높은 셀 다양성의 비효율적인 교 잡 이끌어 낸다. 그러나, 이상의 소화 수 셀 너무 연약 할 중요 한 선도 세척 단계 동안 손실 셀 및 셀 이미징에 대 한 슬라이드 준비 중 붕괴. 따라서, 소화 기간 최적화 매우 중요입니다. 서로 다른 양의 시간에 대 한 동일한 샘플을 소화 하 여 파일럿 smFISH 실험을 실시 하는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 우리 최고의 smFISH 데이터를 얻은 하는 셀의 ~ 80%가 비 굴절 될 때 우리가 소화 중지. 일반적으로, 동일한 성장 조건에 대 한 다른 유전자 돌연변이 체 긴장 비슷한 타이밍으로 소화 될 수 있습니다. 그러나, 소화 기간 다른 성장 조건 및 싹 트는 효 모에 감수 분열의 다른 단계 사이에서 비교 될 때 다릅니다. 타이밍 결정 되 면 smFISH의 품질이 재현 합니다. 참고 결함 세포 벽 합성 또는 구성 돌연변이 체 긴장에 대 한 소화 zymolyase의 다른 배치의 사용 미만 15 분 내에 완료 될 수 있습니다 또한 약간 소화 타이밍을 변경할 수 있습니다.
최적의 프로브 농도 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 필요 합니다. 우리가 설계 하 고 상업적으로 우리의 smFISH 프로브를 구입. 좋은 프로브 (종종 20-메) GC 35%에서 45%, 프로브, 그리고 낮은 분 사이 2 기본적인 쌍의 최소 간격 사이의 비율을 가져야 한다. 우리 프로브, 목록을 생성 하는 제조 업체에서 웹 기반 조사 디자이너를 사용 하 고 충분 한 프로브에서 선택할 수 있다면, 우리는 알고리즘을 사용 폭발 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에서 이상의 17 자료 쌍 겹쳐 프로브를 제거 하 과 다른 게놈 영역입니다. 우리는 더 많은 photostable 형광 염료 (CAL Fluor 590) 때문에이 세트에서 (20 프로브) 위의 기준을 모두 만족 하는 프로브 수 보다 낮은 NDC80luti (CF 590)의 독특한 영역에 anneals 프로브 세트에 대 한 선택은 (~ 25 프로브) 제조업체에서 권장 하는 최소 수입니다. 제조업체의 지침에 따라 프로브 솔루션, 재구성 후 우리가 만든 1시 10분 희석 재고 솔루션의 희석된 솔루션-20 ˚C에서 5 µ L aliquots에 저장. 각 약 수 한 번만 사용 되었다. 최적화, 하나 직렬 해야 희석 1:10에서 희석 솔루션 및 테스트 어느 농도 수익률 최상의 신호 대 잡음 비율. 1: 250, 1: 500, 1:1000, 및 원래 주식에서 1: 2000의 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 1: 500 희석 요인 CF 590 및 Q 670 프로브 세트에 대 한 최상의 신호 대 잡음 비율 귀착되는.
최적의 고정 시간 성공적인 smFISH 신진 효 모에 대 한 중요 한 이기도합니다. 우리는 하룻밤 고정 4 ˚C에서 발견 보다는 크게 meiotic 샘플에 대 한 smFISH 결과의 품질과 일관성을 개선 20 분 동안 실내 온도에 고정. 우리는 테스트 하지 않지만 고정 식물 샘플 영향을 줄 수 어떻게 하룻밤, 실 온에서 고정이 성장 조건을 잘 일했다. 따라서, 새로운 긴장 또는 성장 조건에 대 한 smFISH 프로토콜을 최적화 하려면 좋습니다 실내 온도에 짧은 고정 시간으로 시작 하 고 증가 하는 고정 시간 신호의 높은 다양성 발생 하는 경우.
다른 게시 프로토콜3,,2223와 비교해, 우리의 프로토콜 소화와 교 잡 동안 VRC의 높은 농도 중 VRC RNase 억제제를 사용 합니다. 이 두 단계에의 VRC 추가 향상 smFISH 결과의 일관성 가능성이 더 나은 nuclease 활동, zymolyase 믹스 (효소 원유 추출 물에서 정화와 RNase 포함 될 수 있습니다에 의해 도입 될 수 있습니다에 대 한 RNA 분자를 보존 오염 물질)입니다. 따라서, 우리의 프로토콜 또는 VRC의 최적화를 위한 더 높은 농도에 나와 VRC의 금액을 사용 하는 것이 좋습니다.
셀의 상당 부분 버퍼 B에 formamide 워시 버퍼 세척 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 셀 손실을 줄이기 위해, 하나는 원심 분리 속도 증가할 수 있었다. 우리의 경우, 버퍼 B 동안 우리의 샘플 작은를 고속 (21000 x g)를 사용 하 여 씻어 크게 감소 셀 손실. 그러나, 셀 될 zymolyase 소화 후 매우 깨지기 쉬운 그래서 원심 분리 속도 변경 권장 되지 않습니다. 대신, 셀 formamide 워시 버퍼에서 세척 하는 동안 작은 도움이 크게 미국 과학에서 낮은 접착 튜브 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 지속적으로 효율적인 이미징 충분히 밀도 세포의 단층을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 7 시야를 산출 해야 한다 > 130 셀 정량화에 적합.
마지막으로, 그것은 대 한 최적의 이미지 분석에서 필요한 출력을 결정 하는 것이 중요입니다. SmFISH 관광 명소를 검색, 게시 된 분석 프로그램 일반적으로 배경 신호를 제거 하려면 가우스 알갱이 사용 하 여 원시 이미지를 필터링 하 고 이미지2,17의 각 집합에 대해 사용 하 여 신호 대 잡음 비율을 결정 하기 위해 사용자에 게 요청. 불행히도, 거기 현재는 적절 한 매개 변수 결정 됩니다, 단일 표준 이며 그래서 이러한 다른 설정의 몇 가지 경험적 테스트 하는 것은 필요. 각이 단계에 필요한 매개 변수를 설정 하려면 하나는 반복적으로 다른 매개 변수 집합을 입력 하 고 얼마나 잘 각 세트에서 얻은 결과 일치 하는지 몇 가지 대표적인 셀에서 수동 계산에서 확인 해야 합니다. 매개 변수 한 집합이 발견 되 면 그것은 다른 성장 조건과 유전적 배경에 불구 하 고 얻은 이미지의 대부분을 위해 사용할 수 있습니다.
또한, 하나는 smFISH 이미지의 최대 강도 투영 정량화22전에 수행할 수 있는 경우 테스트할 수 있습니다. 이 단계 자리 탐지 알고리즘을 단순화 하 고 크게 영상 시간, 비록 그들의 subcellular 지 방화 등 개별 관광 명소에 대 한 일부 잠재적으로 유용한 정보 비용 감소. 우리의 경우, NDC80 유전자에 의해 생산 하는 mRNA 분자의 수가 이었다 충분히 낮은 반점 (드문 일 신진 성적 증명서3,7효 모에 대 한)이이 처리 후 잘 분리 되었다. Colocalization 분석 중요 한 경우에 분석 파이프라인 각 smFISH 자리 colocalization를 평가 하기 위해 각 채널에서의 위치를 결정 해야 합니다. 특정 질문에 따라 질문 하 고, 각 명소의 강도 등 다른 정보 또한 추가 분석을 위해 파이프라인에서 압축을 풀 게 할 수 있습니다. 프로토콜에 단계는 키를 최적화와 이미지 분석 파이프라인 관심 질문 공부를 smFISH 데이터의 높은 품질을 얻기에서 결정적 이다.

유전자 발현의 동적 규칙 물질 대사에 유기 체, 환경 스트레스, 감염, 그리고 변화에 응답의 개발 드라이브. RNA 풍부를 측정 하는 기술에 의존 하는 transcriptional 규칙에 집중 하는 연구. 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH), 불리 한 그러한 방법, 단일 셀1,2개별 RNA 분자의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이 메서드는 셀 유전자 발현의 측정 및 세포내 RNA 지역화의 결정을 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용된 smFISH 기술, 개별 RNA 분자의 탐지 여러 짧은 DNA 프로브를 (종종 ~ 48 20-메 르 프로브) 대상 RNA 보완 하 고 같은 형광 염료를 활용 합니다. 약한 신호 귀착되는 단일 형광 프로브의 바인딩 하지만 모든 프로브의 앙상블에서 신호는 강력한. 이 기능은 크게 단일 프로브 오프 대상 바인딩 전시 수 있습니다, 비록 이러한 신호는 될 것으로 예상 매우 약한 대상 RNA 분자3의 비교 때문에 신호 대 잡음 비율을 향상 시킵니다. 오류 검출, 내 RNA 분자의 수는 계산 고 다양 한 성장 조건 및 다른 뮤턴트 들을 비교 될 수 있습니다.
첫 번째 개발, 이후 smFISH 맞게 조정 되었습니다 유전자 식4, 녹음 방송 신장1,2,5,6,7 을 파열 transcriptional 접합 등의 다양 한 측면을 연구 하 , 8 , 9, 세포내 유전자 식10,11,12, 그리고 RNA 지역화13,,1415. 최근에, 우리는이 방법을 사용 하는 동일한 유전자의 두 사본 isoforms의 표정을 연구 하 짧은 사본 isoform (NDC80ORF) 긴 isoform (NDC80luti 와 공유의 전체 순서는 )16. 두 개의 mRNA isoforms를 고유 하 게 식별 하려면 사용 하는 두 개의 프로브 세트: 1 세트 NDC80luti의 독특한 시퀀스에 특정 이며 다른 설정, 다른 형광 성 염료에 활용 된 두 개의 isoforms의 공통 영역에 바인딩합니다. NDC80luti RNA로 식별 됩니다 colocalized 자리 두 형광 신호, 반면에 NDC80ORF RNA만 일반적인 프로브 세트에서 신호를 포함 하는. 수 이후는 NDC80ORF 성적 조사 교 잡의 높은 효율성과 높은 신호 대 잡음 비율은 자신 있게 smFISH 관광 명소를 식별 하 고 오류를 감소 하는 데 필요한 "빼기" 방법에 의해 계산 번 식입니다.
이 문서는 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 smFISH를 수행 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜, 휴대폰 번호, 고정 시간, 소화, 소화 버퍼, 프로브 농도, 시간과 교 잡에서 버퍼 smFISH 실험을 위해 사용 했다 SK1 긴장의 배경 S. cerevisiae 겪고 식물에 대 한 최적화 된 성장 또는 감수 분열입니다. 그러나, 우리는 또한이 원고에 참고: (1) 이미지 수집, 및 (2) 다른 스트레인 배경 및 성장 조건에 대 한 추가적인 최적화 필요할 수 있는 프로토콜의 단계 후 smFISH 데이터의 품질을 확인 하는 메서드.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 단일 셀 검색 하 고 개별 RNA 분자를 계산 하는 능력 때문에 유전자 발현을 연구 하는 강력한 기술입니다. 깊은 시퀀싱 기반 방법 보완, smFISH 사본에 셀 변화와 특정된 RNA의 subcellular 지 방화에 대 한 정보를 제공합니다. 최근, 우리 사용 smFISH 신진 효 모 감수 분열 동안 NDC80 유전자의 표현 연구, 어느 두 기록에서 isoforms 존재 하 고 짧은 사본 isoform는 긴 isoform와 공유의 전체 시퀀스. 각 사본 isoform를 자신 있게 식별 하려면 우리는 알려진된 smFISH 프로토콜을 최적화 하 고 높은 일관성과 신진 동안 샘플에 대 한 smFISH 데이터의 품질을 얻은 감수 분열 효 모. 여기, 우리는이 최적화 된 프로토콜, 우리 smFISH 데이터의 고품질 얻을 여부 및 다른 효 모 종자와 성장 조건에서이 프로토콜을 구현 하기 위한 몇 가지 팁을 확인 하는 데 사용할 조건을 설명 합니다.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

연구

유전학

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...