Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Vi takker Anne Dodson og Stephanie Heinrich for råd om hvordan å optimalisere smFISH protokollen, Xavier Darzacq for hjelp med analyse plattform, Haiyan Huang forslag på den statistiske analysen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra mars Dimes (5-FY15-99), Pew veldedige stiftelser (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) og Glenn Foundation som EÜ og et NSF Graduate forskning Fellowship Grant. DGE-1106400 til JC.

Merk: Alle bufferne og mediene som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1. Leverandørinformasjonen for reagenser er oppført i Tabellen for materiale.
Dag 1/dag 1-2:
Merk: For vegetative kultur, vokse cellene til en OD600 på 0,4 til 0,6 i et foretrukne medium. For meiotic kultur, indusere celler gjennomgå meiose med en foretrukket metode (vanligvis dyrking i et OD600 av 1,85).
1. sample fiksering og fordøyelse
<ol><li>Fastsette totalt ~3.5 OD600 celleområde i 3% formaldehyd.<ol>
<li>For vegetative kultur, legge til 5.52 mL kultur 480 µL av 37% formaldehyd i 15-mL konisk rør.</li>
		<li>For meiotic kultur, Legg 1840 µL av kultur til 160 µL av 37% formaldehyd i 2-mL microcentrifuge rør. Invertere ~ 5 ganger å blande. FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig. Håndtere og kast etter institusjonelle forskrifter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser rør på en rull trommelen ved romtemperatur for 20 min. For meiotic prøver, etter bestemmer ved romtemperatur for 20 min, fortsette å feste natten på 4 grader, roterende. Merk: Overnatting fiksering øker reproduserbarhet og kvaliteten på smFISH dataene innhentet for meiotic prøver. Fiksering tid skal optimaliseres.</li>
	<li>Mens prøvene er fikse, tine 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplekser (VRC) på 65 grader i minst 10 min.</li>
	<li>Klargjør fordøyelsen master blandingen i en 15-mL tube: 1 sample, blande 425 µL av Buffer B med 40 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader); 5 eksempler, blande 2125 µL av Buffer B med 200 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader). Vortex ~ 5 s å fullt resuspend VRC før du legger til master mix, som vises lys grønn etter VRC. Merk: Tillegg av VRC under fordøyelsen forbedrer konsistensen av smFISH resultater, potensielt begrenser nuclease miljøgifter introdusert av zymolyase blandingen, som er renset fra rå ekstrakt. Mengden VRC kreves i dette trinnet skal optimaliseres.</li>
	<li>For vegetative prøver, sentrifuge rør ~ 1057 x g i 3 minutter. For meiotic prøver (etter overnatting fiksering), sentrifuge 21000 x g i 1,5 min. Decant eller Sug opp nedbryting til formaldehyd avfall. Merk: Alle sentrifugering trinnene utføres ved romtemperatur.</li>
	<li>Resuspend celler i 1,5 mL kaldt Buffer B ved pipettering opp og ned eller invertere rør og flicking for å blande. Overføre vegetative prøver til 2-mL rør etter rørets.</li>
	<li>Sentrifuger 21000 x g i 1,5 min. fjerne mesteparten av væsken vakuum aspirasjon eller pipettering, etterlot ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend cellene i 1,5 mL kaldt Buffer B.</li>
	<li>Sentrifuger 21000 x g i 1,5 min. fjerne mesteparten av væsken vakuum aspirasjon eller pipettering, etterlot ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend celler i 1,5 mL kaldt Buffer B. sentrifuge 21000 x g for 1,5 min. leveringstanken væsken helt av vakuum eller pipettering.</li>
	<li>Resuspend celler i 425 µL av fordøyelsen master mix og kort vortex å resuspend. Legge til 5 µL av 100T 10 mg/mL zymolyase i hver retning. Merk: Vortex zymolyase hver gang før du legger til rør. Legge til zymolyase til hver tube enkeltvis, i stedet for å legge til master mix. Begge trinnene hjelpe opprettholde fordøyelsen konsekvens mellom rør fordi zymolyase precipitates raskt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s å blande. Plassere rør på en rull trommel og fordøye på 30 grader i 15-30 min. Vegetative celler og tidlig meiotic fase, tar det vanligvis ~ 15 min, og meiotic prophase og meiotic divisjoner, det tar vanligvis ~ 30 min. Merk: Kontroller på mikroskopet hver 5 min etter 15 min, og stoppe fordøyelsen når ~ 80% av celler vises ikke-transparente og ikke-refraktiv. Fra dette punktet, celler er svært skjøre. Håndtere celler forsiktig og unngå å bruke vakuum aspirasjon eller vortexing.
</li>
	<li>Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. Fjern væsken helt av pipettering.</li>
	<li>Forsiktig resuspend celler med 1 mL av Buffer B av pipettering opp og ned 1 - 2 ganger å blande.</li>
	<li>Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. fjerne Buffer B væske av pipettering. Forsiktig resuspend celler i 1 mL av 70% etanol (fortynnet med RNase-fritt vann).</li>
	<li>Inkuber ved romtemperatur i 3,5-4 timer.</li>
</ol>2. hybridisering
<ol><li>Ta formamide til romtemperatur (for 50-mL aliquot, det tar ~ 30 min i vannbad). Merk: Ikke åpne formamide flasken til flasken når romtemperatur for å unngå oksidasjon av formamide. FORSIKTIG: Formamide er giftige. Håndtere og kast etter institusjonelle forskrifter.</li>
	<li>Forberede 10% formamide vaskebuffer i et 15-mL konisk rør.</li>
	<li>Sentrifuge rør ~ 376 x g for 3 min. fjerne 500 µL av 70% etanol av pipettering. Pipetter forsiktig opp og ned til resuspend de gjenværende cellene, og deretter overføre cellene til lav-vedheft rør. Merk: Ved hjelp av lav-vedheft rør sterkt reduserer celle tap under senere.</li>
	<li>Sentrifuge rør igjen på ~ 376 x g for 3 min. Fjern alle etanol av pipettering.</li>
	<li>Legge 1 mL av 10% formamide vaskebuffer og forsiktig Pipetter opp og ned 2 - 3 ganger til resuspend cellene.</li>
	<li>At cellene å sitte ved romtemperatur for ~ 20 min klargjøring hybridisering løsningen. 1 sample, blande 50 µL av hybridisering Buffer (rom temperament), 5 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader) og 1 µL av hver probe (200 nM endelig). 5 eksempler, blande 250 µL av hybridisering Buffer (rom temperament), 25 µL av 200 mM VRC (oppvarmet til 65 grader) og 5 µL av hver probe (200 nM endelig).<ol>
<li>Tine hybridisering Buffer (frossen på-20 grader) til romtemperatur før røret å hindre formamide oksidering.</li>
		<li>Etter tilføyer den 200 mM VRC, vortex for 5-10 s. før du legger ut sonder, er som designet og kjøpt kommersielt, og rekonstituert i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Hvis to sonder er co inkubert, legger 1 µL av 1:10 fortynning av sonden #1 stock samt 1 µL av 1:10 fortynning av sonden #2 aksjen, å gjøre en siste fortynning av ~ 1:500 for hver probe. Konsentrasjonen trengs for best signal-til-støy-forhold må være optimalisert (se diskusjon for detaljer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting i farlig avfall av pipettering.</li>
	<li>Legge til minst 50 µL av hybridisering løsning i hver retning. Sveip rør for å blande.</li>
	<li>Ruge på 30 grader på en rull tromme minst 16 timer i mørket.</li>
</ol>Dag 2/dag 3
3. vask og tenkelig
<ol><li>Ta formamide til romtemperatur.</li>
	<li>Forberede 10% formamide vaskebuffer (FWB) i en 15-mL konisk rør.</li>
	<li>Fjern rørene fra Berg trommelen og plassere dem i en folie-dekket for å beskytte mot lyset.</li>
	<li>Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting i farlig avfall av pipettering.</li>
	<li>Resuspend i 1 mL av 10% FWB av pipettering forsiktig opp og ned 2 - 3 ganger.</li>
	<li>Ruge på 30 grader i 30 min (ikke roterer) i boksen folie-dekket.</li>
	<li>Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. fjerner nedbryting til farlig avfall av pipettering, og la ~ 50 µL.</li>
	<li>I mellomtiden forbereder DAPI/FWB i et 15-mL konisk rør: 1 sample, blande 1000 µL av 10% formamide vaskebuffer med 1 µL av 5 mg/mL DAPI. For 10 prøver, bland 10 mL av 10% formamide vaskebuffer med 10 µL av 5 mg/mL DAPI. Resuspend i 1 mL av DAPI/FWB av pipettering forsiktig opp og ned 2 - 3 ganger.</li>
	<li>Ruge på 30 grader i 30 min (ikke roterer) i boksen folie-dekket.</li>
	<li>Tine anti-blekemiddel reagenser på is.</li>
	<li>Sentrifuge prøvene ~ 376 x g for 3 min. Fjern nedbryting helt av pipettering. Eventuelt sentrifuge igjen for å fjerne alle nedbryting.</li>
	<li>For prøver som ikke er avbildet umiddelbart, resuspend pellet i 50 µL av GLOX Buffer uten enzymer. Pipetter opp og ned 3 - 4 ganger å blande.<ol>
<li>Holde alle unimaged prøvene i boksen folie-dekket på 4 grader til du er klar til bildet. Når du er klar å image, sentrifuge prøvene ~ 376 x g i 2 minutter og fjerne nedbryting helt ved pipettering. Resuspend i GLOX med enzymer som nedenfor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prøver å være fotografert umiddelbart legge 15-20 µL av GLOX buffer med enzymer. Pipetter forsiktig opp og ned for å blande. Merk: Volumet lagt kan variere avhengig av det cellen pellet. Vi anbefaler resuspending av pellets i 15 µL av GLOX buffer med enzymer og finne celle tettheten på mikroskopet. Hvis cellene er for tette (celler clumping oppå hverandre), kan du legge til ekstra GLOX buffer med enzymer. Hvis cellene er for sparsom, sentrifuge utvalget og fjerner ~ 5 µL av bufferen.</li>
	<li>Pipetter 5 µL mot dekkglassvæske (18 mm x 18 mm, nr. 1), og sette dekkglassvæske på et lysbilde.</li>
	<li>Sette en laboratorium tørke på lysbildet der dekkglassvæske er plassert. Trykk forsiktig på laboratoriet tørke sette lysbildet (burde se flytende kommer ut fra alle fire kanter på dekkglassvæske).</li>
	<li>Overføre lysbildet til mikroskopet rommet i en boks dekket av aluminiumsfolie.</li>
	<li>Bildet med et bredt felt fluorescens mikroskop med forstørring (60-100 X) og høy numeriske blenderåpning. Merk: For å samle maksimal fotoner fra smFISH sonder, AC confocal mikroskop anbefales ikke, som de betydelig begrense mengden lys inn. Her dataene ble samlet på et mikroskop utstyrt med 100 X, 1,4 NA mål, bruke filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) avbildet på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; og DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% T. En referanseavbildning av lyse-feltet bør også være ervervet. Få 15-25 skiver trinn størrelse 0.1-0.2 µm, fra helt under fokus for synsfelt helt over, for å sikre at alle RNA flekker regnskapsføres.</li>
</ol>4. bildeanalyser
<ol><li>Analysere smFISH data publisert smFISH analyseverktøy som fisk-quant17 og StarSearch2eller skreddersydde programmer, avhengig av nøyaktig hva eksperimentet. Merk: En god analyse rørledning bør tillater brukere å bestemme en terskel til å skille ekte RNA flekker fra bakgrunnen, og statistikk som X, Y og Z (valgfritt) koordinatene og intensiteten på hvert sted, hvor mange steder i hver celle , og muligens passende parametere som en måte å filtrere ut false oppdagelsen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.

Protokollen presenteres her er avledet fra andre publiserte smFISH protokoller2,3,21,22,23, og er spesielt optimalisert for gjær belastning bakgrunnen SK1. Parameterne optimalisert inkludert celle nummer, fiksering varigheten, sentrifugering hastigheten og varighet, fordøyelsen varighet, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon og hybridisering buffer. Andre parametere som hybridisering temperatur og varigheten var ikke optimalisert. I denne delen dele vi noen notater som kan tilpasse denne protokollen for eventuelle gjær belastning bakgrunn og vekst forholdene rundt.
Cellen vegg av spirende gjær er en stor utfordring mot å oppnå høy kvalitet smFISH bilder i spirende gjær fordi cellen vegg forhindrer sonde penetrasjon. Ufullstendig fordøyelsen av cellen vegg av zymolyase fører til ineffektiv hybridisering sonder og høye celle til celle variasjon i signal. Men kan over fordøyelsen gjøre celler for skjøre, fører til betydelig celle tap under vask trinnene og cellen sprengning under lysbildet forberedelse for bildebehandling. Dermed er optimalisere varigheten av fordøyelsen avgjørende. Vi anbefaler å gjennomføre en pilot smFISH eksperiment ved å fordøye samme utvalget for forskjellige mengder tid. I vårt tilfelle oppnådd vi best smFISH dataene hvis vi stoppet fordøyelsen når ~ 80% av celler ble ikke-refraktiv. Vanligvis for samme vekst betingelsen, kan ulike genetisk muterte stammer bli fordøyd med lignende timing. Varigheten av fordøyelsen er imidlertid sammenlignet blant annet vekst forhold og ulike stadier av meiose i spirende gjær. Når tidspunktet er bestemt, er kvaliteten på smFISH reproduserbare. Merk kan at for mutant stammer med defekt cellevegg syntese og/eller sammensetning, fordøyelsen kan gjennomføres på mindre enn 15 min. Bruk av ulike grupper av zymolyase også litt endre fordøyelsen timing.
Optimal sonde konsentrasjon er nødvendig for å oppnå en høy signal-til-støy-forhold. Vi designet og kjøpt våre smFISH sonder kommersielt. God sonder (ofte 20-mers) bør ha en prosentandel av GC spenner fra 35% til 45%, en avstand på 2 base parene mellom sonder, og lav kryss-reaktivitet minst. Vi brukte en webbasert sonde designer fra produsenten til å generere en liste over sonder, og hvis det var nok sonder å velge mellom, vil vi bruke BLAST algoritmen i Saccharomyces genomet databasen for å eliminere sonder med mer enn 17 base parene overlappet med andre genomisk. Vi valgte mer photostable fluorescerende farge (CAL Fluor 590) for sonden settet som anneals til den unike regionen NDC80luti (CF 590) fordi i dette settet, antall sonder som fornøyd alle de ovennevnte kriteriene (20 sonder) var lavere enn den minimum antall anbefalt av produsenten (~ 25 sonder). Etter gjenoppbygge sonde løsningen etter produsentens instruksjoner, gjorde vi en 1:10 fortynning av lager løsningen og lagret utvannet løsningen i 5-µL dele på-20 grader. Hver aliquot ble brukt bare en gang. For optimalisering, bør man gjøre føljetong fortynninger fra 1:10 utvannet løsning og test som konsentrasjon gir best signal-til-støy-forhold. Vi anbefaler å foreta en fortynning rekke 1:250, 1:500, 1:1000 og 1:2000 fra det opprinnelige lageret. I vårt tilfelle førte en fortynningsfaktoren for 1:500 beste signal-til-støy forholdet, for både CF 590 og Q 670 sonde sett.
Optimal fiksering tid er også avgjørende for vellykket smFISH i spirende gjær. Vi fant at natten fiksering på 4 grader, snarere enn fikse ved romtemperatur for 20 min, forbedret konsistens og kvaliteten på smFISH resultatene for meiotic prøver. Selv om vi ikke har testet hvordan natten fiksering kan påvirke vegetative prøver, fiksering ved romtemperatur fungerte bra for denne veksten tilstanden. Dermed for å optimalisere smFISH protokollen for nye stammer eller betingelser for vekst, anbefaler vi starter med kort fiksering tid ved romtemperatur og øke fiksering tid hvis det høye variasjon av signal.
Sammenlignet med andre publiserte protokoller3,22,23, bruker vår protokollen den RNase inhibitor VRC under fordøyelsen og en høyere konsentrasjon av VRC under hybridisering. Tillegg av VRC i disse to trinnene forbedret konsistensen av smFISH resultatene, muligens med bedre bevare RNA molekyler mot nuclease aktivitet, som kan være innført av zymolyase mix (enzymet er renset fra råolje ekstrakter og kan inneholde RNase forurensninger). Derfor anbefaler vi bruker mengde VRC som er oppført i protokollen eller enda høyere konsentrasjoner av VRC for optimalisering.
En betydelig del av cellene kan gå tapt under vask trinnene i både Buffer B og vaskebuffer formamide. For å redusere tap av cellen, kan en øke sentrifugering hastigheten. I vårt tilfelle vasker med høy hastighet (21000 x g) for å pellets våre prøver under Buffer B reduserte celle tap. Imidlertid blir celler svært skjøre etter zymolyase fordøyelsen, slik endring sentrifugering hastigheten ikke anbefales. I stedet foreslår vi bruke lav-vedheft rørene fra USA vitenskapelig, som hjelper pellets cellene under vasker i formamide vaske bufferen. Samlet kan våre protokollen konsekvent generere en monolayer av celler tett nok for effektiv bildebehandling. Vanligvis 7 synsfelt skal gi > 130 celler egnet for kvantifisering.
Endelig er det viktig å bestemme optimale parametere for og utganger behov fra bildeanalyser. For å finne smFISH steder, publiserte analyse programmer vanligvis filtrere raw-bilder bruke Gaussian kjernen til å fjerne bakgrunn signal, og be brukerne å bestemme signal-til-støy forholdet skal brukes for hvert sett med bilder2,17. Dessverre, det er ikke en enkelt standard som riktige parametere er bestemt, og så noen empirisk testing av disse forskjellige innstillinger er nødvendig. Hvis du vil angi parametere som kreves for hver av disse trinnene, må man iterativt inn ulike sett med parametere og sjekke hvor godt resultatene fra hvert kamper som fra manuell telling i noen representant celler. Når et sett med parametere er funnet, kan den brukes for det meste av bilder innhentet til tross for ulike vekst forhold og genetisk bakgrunn.
I tillegg kan en test Hvis maksimalt intensitet projeksjon av smFISH bildene kan utføres før kvantifisering22. Dette trinnet forenkler den spot algoritmen og reduserer tenkelig tid, men på bekostning av noen potensielt nyttig informasjon om enkeltsteder, som deres subcellular lokalisering. I vårt tilfelle var antall mRNA molekyler produsert av NDC80 genet lav nok til at de ble godt skilt etter denne behandling (ikke uvanlig for utskrifter i spirende gjær3,7). I tilfeller der colocalization analyse er kritisk må analyse rørledningen bestemme plasseringen av hver smFISH spot i hver enkelt kanal å vurdere colocalization. Avhengig av konkrete spørsmål blir spurt, annen informasjon som intensiteten av hver spot må også hentes fra pipeline for videre analyse. Optimalisere nøkkelen trinn i protokollen og rørledningen bildet analyse er avgjørende i å få høy kvalitet for smFISH å studere spørsmålet rundt.

Dynamisk regulering av genuttrykk kjører utviklingen av en organisme, samt sitt svar på miljøstress, infeksjon og endringer i metabolisme. Studier som fokuserer på transcriptional regulering avhengige teknologier som måler RNA overflod. En slik metode, kalt ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH), brukes for påvisning av RNA molekyler i enkeltceller1,2. Denne metoden tillater måling av celle-til-celle variasjon i genuttrykk og fastsetting av intracellulær RNA lokalisering.
Det mest brukte smFISH teknikken krever oppdagelsen av en individuell RNA molekylet flere kort DNA sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder) som er komplementære til målet RNA og er konjugert til samme fluorescerende farge. Binding av en enkelt fluorescerende sonde gir svakt signal, men signalet fra ensemblet i alle sonder er robust. Denne funksjonen forbedrer signal-til-støy-forhold fordi selv om en enkelt sonde kan vise off-målet bindende, slik signalet forventes å bli veldig svak sammenlignet med målet RNA molekylet3. I feil gjenkjenning, kan antall RNA molekyler telles og forhold i ulike vekst forhold og blant annet mutanter.
Siden sin første utvikling, har smFISH blitt tilpasset for å studere ulike aspekter av gene expression4, som transkripsjon forlengelse1,2, skjøting5,6, transcriptional sprengning7 , 8 , 9, intracellulær allel uttrykk10,11,12og RNA lokalisering13,14,15. Nylig vi har brukt denne metoden for å studere uttrykk for to transkripsjon isoformene på det samme genet, der kort transkripsjon isoformen (NDC80ORF) har hele sekvensen delt med den lange isoformen (NDC80luti )16. Identifiserer de to mRNA isoformene, vi brukte to sonde sett: ett gjelder unike sekvensen av NDC80luti, og andre settet, konjugert til en annen fluorescerende farge, binder til vanlige regionen de to isoformene. NDC80luti RNA identifiseres som en colocalized sted med både fluorescerende signaler, mens den NDC80ORF RNA er en som inneholder bare signalet fra det felles settet som sonde. Siden antallet av NDC80ORF utskrifter beregnes ved en "subtraksjon" metode, høy effektivitet av sonden hybridisering og høy signal-til-støy forholdet er trygt identifisere smFISH flekker og redusere feil overføring.
Dette dokumentet beskriver en optimalisert protokoll for å utføre smFISH i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokollen, de celle nummer, fiksering, fordøyelsen tid, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon, og hybridisering bufferen for smFISH eksperimentene var optimalisert for SK1 belastning bakgrunnen av S. cerevisiae gjennomgår vegetative vekst eller meiose. Men vi også merke i dette manuskriptet: (1) metode for å sjekke kvaliteten på dataene som smFISH etter bildeopptak, og (2) skritt i protokollen som krever ytterligere optimalisering for ulike belastning bakgrunner og vekst forhold.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfull teknikk å studere genuttrykk i enkeltceller på grunn av sin evne til å oppdage og telle RNA molekyler. Utfyllende til dyp sekvensering-baserte metoder, smFISH gir informasjon om celle-til-celle variasjonen i transkripsjon overflod og den subcellular lokaliseringen av en gitt. Nylig har vi brukt smFISH å studere uttrykket av genet NDC80 under meiose i spirende gjær, i hvilke to transkripsjon isoformene finnes og kort transkripsjon isoformen har hele sekvensen delt med den lange isoformen. Trygt Finn hver utskrift isoformen, vi optimalisert kjent smFISH protokoller og høy konsistens og kvaliteten på smFISH data for prøvene ervervet under spirende gjær meiose. Her beskriver vi denne optimalisert protokollen, kriteriene som brukes for å avgjøre om høy kvalitet smFISH data hentes, og noen tips for å implementere denne protokollen i andre gjær påkjenningen og vekst betingelser.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Denne enkel molekyl fluorescens i situ hybridisering protokollen er optimalisert for å tallfeste antallet RNA molekyler i spirende gjær under vegetativ vekst og meiose.

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Enkelt Molecule Analyse av Laser Lokalisert psoralen addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...