Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Мы благодарим Anne Додсон и Стефани Генрих за советом о том, как оптимизировать smFISH протокол, Ксавье Darzacq для помочь с платформой анализа, Хуан Хайянь для предложения о статистическом анализе. Эта работа была поддержана средств от марта Dimes (5-FY15-99), благотворительные фонды Пью (00027344), Фонд исследований рака Дэймон Раньон (35-15) и Гленн фонд EÜ и NSF выпускник исследовательских стипендий Грант № DGE-1106400 для JC.

Примечание: Все буферы и средствами массовой информации, используемые в настоящем Протоколе, перечислены в таблице 1. Вендора для реагентов, перечисленных в Таблице материалов.
День 1/день 1-2:
Примечание: Растительные культуры, растут клетки ОД600 от 0,4 до 0,6 в предпочтительным средством. Для meiotic культуры заставить клетки пройти мейоз, предпочтительным методом (обычно культивирования в ОД600 1,85).
1. образец фиксации и пищеварение
<ol><li>Исправьте в общей сложности ~3.5 ОД600 клеток в 3% формальдегида.<ol>
<li>Для растительные культуры добавьте 5.52 мл культуры 480 мкл 37% формальдегида в 15 мл конические трубы.</li>
		<li>Для meiotic культуры мкл 1840 культуры до 160 мкл 37% формальдегида в 2-мл microcentrifuge трубы. Инвертировать ~ 5 раз, чтобы перемешать. Предупреждение: Формальдегид токсичных. Обрабатывать и распоряжаться согласно нормативных положений.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Место труб на роликовых барабан при комнатной температуре за 20 мин. Для meiotic образцы, после фиксации при комнатной температуре в течение 20 мин, по-прежнему фиксации на ночь при 4 ° c, вращающиеся. Примечание: Ночь фиксации увеличивает воспроизводимость и качество полученных meiotic образцов данных smFISH. Время фиксации должны быть оптимизированы.</li>
	<li>В то время как фиксации образцов, оттепель 200 мм ванадила Ribonucleoside комплексов (ВРЦ) на 65 градусов по крайней мере 10 минут.</li>
	<li>Подготовка мастер смесь пищеварение в 15 мл: 1 образец, смешать 425 мкл буфера B с 40 мкл 200 мм VRC (прогреты до 65 ° c); для 5 образцов смесь 2125 мкл буфера B с 200 мкл 200 мм VRC (прогреты до 65 ° c). Вихревой ~ 5 s полностью Ресуспензируйте VRC перед добавлением в Мастер микс, который появится после сложения VRC света коричнево-зелёного. Примечание: Добавление VRC во время пищеварения улучшает консистенцию smFISH результатов, потенциально, подавляя нуклеиназы загрязнителем, представленный в zymolyase смесь, которая очищается от сырой экстракт. Количество VRC, необходимых на данном этапе должны быть оптимизированы.</li>
	<li>Для вегетативного образцов центрифуга трубы на x ~ 1057 г за 3 мин. Изучали образцы (после ночи фиксации) центрифуги на 21 000 x g 1,5 мин Decant или аспирационная супернатант формальдегида отходы. Примечание: Все центрифугирования шаги выполняются при комнатной температуре.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера B закупорить вверх и вниз или инвертирование трубы и стряхивая смешивать. Передача вегетативных проб в 2-мл пробирки после взмучивания.</li>
	<li>Центрифуг в 21000 g x 1,5 мин удалить основную часть жидкости путем вакуумной аспирации или закупорить, оставив позади ~ 100 мкл.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера б.</li>
	<li>Центрифуг в 21000 g x 1,5 мин удалить основную часть жидкости путем вакуумной аспирации или закупорить, оставив позади ~ 100 мкл.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл холодного буфера B. центрифуги на 21 000 x g 1,5 мин аспирата жидкость полностью вакуума или закупорить.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в 425 мкл мастер смеси пищеварение, и кратко вихревой Ресуспензируйте. 5 мкл zymolyase 100т 10 мг/мл, к каждой трубе. Примечание: Вихрь zymolyase каждый раз, когда перед добавлением к трубкам. Добавьте zymolyase в каждую пробирку индивидуально, вместо добавления мастер смесь. Оба шага помогают поддерживать пищеварение согласованность трубы потому что zymolyase осаждает быстро.</li>
	<li>Вихрь 2-3 s смешивать. Место труб на барабане ролика и дайджест на 30 градусов для 15-30 мин. Для растительных клеток и ранних стадиях meiotic обычно это занимает ~ 15 мин, и для meiotic профаза и meiotic подразделений, обычно это занимает ~ 30 мин. Примечание: Проверка на микроскопе каждые 5 минут через 15 мин и остановить пищеварения когда ~ 80% клеток появляются нетранспарентные и не рефракции. От этой точки зрения, клетки являются очень хрупкими. Аккуратно обработать клетки и избегать использования вакуумной аспирации или vortexing.
</li>
	<li>Центрифуга трубы на ~ 376 x g на 3 мин удалить жидкость полностью, закупорить.</li>
	<li>Нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл буфера B, закупорить вверх и вниз на 1 - 2 раза в смесь.</li>
	<li>Центрифуга трубы на ~ 376 x g на 3 мин удалить B буферной жидкости, закупорить. Нежно ресуспензируйте клеток в 1 мл 70% этанола (разбавленный водой, RNase бесплатно).</li>
	<li>Инкубируйте 3,5-4 часа при комнатной температуре.</li>
</ol>2. Гибридизация
<ol><li>Довести до комнатной температуры формамид (для 50 мл Алиготе, она занимает ~ 30 мин на водяной бане). Примечание: Не открывайте формамид бутылку до тех пор, пока бутылка достигнет комнатной температуры во избежание окисления формамида. Предупреждение: Формамид является токсичным. Обрабатывать и распоряжаться согласно нормативных положений.</li>
	<li>Подготовка 10% формамида мыть буфер в 15 мл Конические трубки.</li>
	<li>Центрифуга трубы на ~ 376 x g для 3 мин удалить 500 мкл 70% этанола, закупорить. Аккуратно накапайте вверх и вниз для Ресуспензируйте оставшиеся ячейки, а затем перенесите клетки с низким сцеплением трубок. Примечание: Использование низким сцеплением трубы значительно уменьшает потери клеток во время последующих моек.</li>
	<li>Центрифуга трубы снова на ~ 376 x g на 3 мин удалить все этанола, закупорить.</li>
	<li>Добавить 1 мл 10% формамида мыть буфер, и аккуратно накапайте вверх и вниз 2 - 3 раза Ресуспензируйте клетки.</li>
	<li>Позволяют клеткам сидеть при комнатной температуре ~ 20 мин при подготовке решения гибридизации. 1 образец Смешайте 50 мкл буфера гибридизации (номер temp.), 5 мкл 200 мм VRC (разогрет до 65 градусов) и 1 мкл каждого зонда (финал 200 Нм). Для 5 образцов смесь 250 мкл буфера гибридизации (номер temp.), 25 мкл 200 мм VRC (разогрет до 65 градусов) и 5 мкл каждого зонда (финал 200 Нм).<ol>
<li>Оттепель гибридизации буфера (заморожен на уровне-20 ° c) до комнатной температуры перед открытием трубки для предотвращения окисления формамида.</li>
		<li>После добавления 200 мм VRC, вихревые для 5-10 s перед добавлением зонды, которые разработаны и приобрели коммерчески и восстановлена в соответствии с инструкциями производителя.</li>
		<li>Если два зонда совместно коммерсантам, 1 мкл 1:10 разрежения зонд #1 акции, а также 1 мкл в 1:10 разрежения зонд #2 акций, чтобы сделать окончательный разбавление ~ 1: 500 для либо зонд. Концентрации, необходимые для лучший сигнал шум коэффициент должен быть оптимизирован (см. обсуждение для подробной информации).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант в опасных отходов, закупорить.</li>
	<li>По крайней мере 50 мкл раствора гибридизации к каждой трубе. Флик трубы смешивать.</li>
	<li>Инкубируйте на 30 градусов на барабане ролик для по крайней мере 16 часов в темноте.</li>
</ol>День 2/день 3
3. Мойка и обработка изображений
<ol><li>Формамид довести до комнатной температуры.</li>
	<li>Подготовка 10% формамида мыть буфера (FWB) в 15 мл Конические трубки.</li>
	<li>Удаление трубы из ролика барабана и поместите их в окно фольги покрыты для защиты от света.</li>
	<li>Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант в опасных отходов, закупорить.</li>
	<li>Ресуспензируйте в 1 мл 10% FWB, нежно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза.</li>
	<li>Инкубируйте на 30 градусов за 30 мин (не вращается) в поле покрытый фольгой.</li>
	<li>Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g для 3 мин удалить супернатант для опасных отходов, дозирование и оставить ~ 50 мкл.</li>
	<li>Тем временем подготовить DAPI/FWB в 15 мл Конические трубки: 1 образец, смешать с 1 мкл 5 мг/мл DAPI 1000 мкл 10% формамида мыть буфера. Для 10 образцов Смешайте 10 мл 10% формамида мыть буфера с 10 мкл 5 мг/мл DAPI. Ресуспензируйте в 1 мл DAPI/FWB, нежно закупорить вверх и вниз 2 - 3 раза.</li>
	<li>Инкубируйте на 30 градусов за 30 мин (не вращается) в поле покрытый фольгой.</li>
	<li>Оттепель анти отбеливатель реагентов на льду.</li>
	<li>Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 3 мин удалить супернатант полностью, закупорить. При необходимости, центрифуга снова, чтобы удалить все супернатант.</li>
	<li>Для образцов, которые отражаются не сразу Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл буфера GLOX без ферментов. Накапайте вверх и вниз 3 - 4 раза для смешивания.<ol>
<li>Держите все unimaged образцы в поле фольги, покрытой на 4 ° c до готовности к изображению. Когда все готово к изображению, Центрифугуйте образцы на ~ 376 x g на 2 мин и полностью удалить супернатант, закупорить. Ресуспензируйте в GLOX с ферментами, как показано ниже.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Для образцов изображаемого немедленно, добавить 15-20 мкл буфера GLOX с ферментами. Аккуратно накапайте вверх и вниз, чтобы смешать. Примечание: Объем добавил может варьироваться в зависимости от размера ячейки Пелле. Мы рекомендуем resuspending гранулы в 15 мкл буфера GLOX с энзимами и проверьте плотность ячеек на микроскопе. Если клетки являются слишком плотной (клетки слипания друг на друга), добавьте дополнительный буфер GLOX с ферментами. Если клетки слишком разреженный, центрифуга образца и удалить ~ 5 мкл буфера.</li>
	<li>Накапайте 5 мкл на coverslip (18 x 18 мм, № 1) и положить coverslip на слайде.</li>
	<li>Положите Лаборатория очистки поверх слайда, где находится coverslip. Аккуратно нажмите на стирание лаборатории для установки слайд (должны увидеть жидкость, отрываясь от всех четырех краев coverslip).</li>
	<li>Передача слайд в Микроскоп комнату в коробке, охватываемых алюминиевой фольги.</li>
	<li>Изображение с помощью микроскопа-поля флуоресценции с высоким увеличением (60-100 X) и высокая числовая апертура. Примечание: Собрать максимальное количество фотонов, испускаемых smFISH зонды, конфокальные микроскопы не рекомендуется, так как они значительно ограничивают количество света должны быть собраны. Здесь, данные были собраны на микроскоп оснащен 100 X, 1.4 NA цели, используя фильтры CY5 (EX632/22, EM679/34) образы на 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; и DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% т. Должно быть также приобретено ярко поле эталонный образ. Приобрести 15-25 фрагменты с шагом размером 0,1-0,2 мкм, от полностью ниже в центре поля зрения полностью выше, с целью обеспечить, чтобы все пятна РНК приходится.</li>
</ol>4. анализ
<ol><li>Проанализируйте данные smFISH с инструменты анализа опубликованных smFISH таких как рыбы Квант17 и StarSearch2, или индивидуальных программ, в зависимости от конкретных требований эксперимента. Примечание: Хороший анализ трубопровода следует позволить пользователям определить порог отделить истинное РНК пятна от фона, и вывода статистики, например координаты X, Y и Z (опционально) и интенсивности каждого пятна, количество точек в каждой ячейке и возможно установка параметров как способ фильтрации ложных срабатываний.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Протокол, представленные здесь является производным от других22,21,2,3,23с опубликованной smFISH протоколы и специально оптимизирован для фона штамм дрожжей SK1. Оптимизированные параметры включали номер ячейки, длительность фиксации, скорость центрифугирования и продолжительность, продолжительность переваривания, пищеварение буфер, зонд концентрации и гибридизации буфера. Другие параметры, такие как гибридизации температуры и продолжительность не оптимизированы. В этом разделе мы разделяем несколько нот, которые помогли бы адаптировать этот протокол к любой фон штамм дрожжей и условий роста интереса.
Клеточной стенки многообещающий дрожжей является одной из основных задач против получения изображения высокого качества smFISH в многообещающий дрожжей, потому что клеточной стенки предотвращает проникновение зонда. Неполное переваривание клеточной стенки, zymolyase приводит к неэффективной Гибридизация зондов и высокой изменчивости к ячейке в сигнал. Однако, чрезмерной пищеварение может сделать слишком хрупкие клетки, приводит к значительным ячейка потерь во время стирки шаги и ячеек лопаются во время подготовки слайд для воображения. Таким образом крайне важно оптимизировать продолжительность переваривания. Мы рекомендуем проведение экспериментального smFISH эксперимент, переваривание того же образца для различное количество времени. В нашем случае мы получили лучшее smFISH данных если мы остановились пищеварение, став не преломления ~ 80% клеток. Как правило для же условия роста, различных генетических мутантных штаммов можно переваривается с аналогичные сроки. Однако продолжительность переваривания отличается в сравнении между различными роста условиях и разных стадиях мейоза в многообещающий дрожжей. После того, как определяется время, качество smFISH воспроизводимость. Обратите внимание что мутантных штаммов с синтезу дефектных клеточной стенки и/или состава, пищеварение может быть завершена в менее чем 15 минут использование различных партий zymolyase может также слегка изменить сроки пищеварение.
Оптимальное зонд концентрация необходима для достижения высокое соотношение сигнал шум. Мы разработан и приобрели наши smFISH зонды коммерчески. Хороший зонды (часто 20-РВК) должны иметь процент от 35% до 45%, минимальное расстояние между 2 пар нуклеотидов, между зонды и низкой перекрестной реактивности GC. Мы использовали зонд, веб-дизайнер от производителя для создания списка зондов, и если там было достаточно зонды, чтобы выбрать из, мы будет использовать алгоритм взрыва в базе данных генома Saccharomyces для ликвидации зонды с более чем 17 пар перекрываются с другими геномной регионами. Мы выбрали более фотостабилен Люминесцентную краску (CAL Fluor 590) для набора зонд, который anneals в уникальный регион NDC80luti (CF 590), потому что в этом наборе, количество датчиков, которые удовлетворены все из вышеупомянутых критериев (20 зонды) был ниже, чем Минимальное количество, рекомендованного изготовителем (~ 25 зондов). После воссоздания зонд решения следуя инструкциям производителя, мы сделали 1:10 разрежения Стоковый раствор и хранятся разбавленный раствор в 5 мкл аликвоты на уровне-20 ° c. Каждый Алиготе был использован только один раз. Для оптимизации, надо сделать последовательный разведениях от 1:10 разбавленный раствор и тест какой концентрации дает лучшее соотношение сигнал шум. Мы рекомендуем сделать серию разбавления 1: 250, 1: 500, 1: 1000 и 1: 2000 из исходного сырья. В нашем случае коэффициент разбавления 1: 500 привела к лучшее соотношение сигнал шум в CF 590 и Q 670 зонд наборов.
Оптимальную фиксацию времени также имеет решающее значение для успешного smFISH в многообещающий дрожжей. Мы нашли что ночь фиксации на 4 ° c, а не фиксации при комнатной температуре в течение 20 мин, значительно улучшить последовательность и качество результатов smFISH meiotic образцов. Хотя мы не испытали, как ночь фиксации может повлиять вегетативных проб, фиксация при комнатной температуре работал хорошо для этого условия роста. Таким образом чтобы оптимизировать smFISH протокол для новых штаммов или условий роста, мы рекомендуем, начиная с короткой фиксации времени при комнатной температуре и увеличивая время фиксации, если обнаружена высокая изменчивость сигнала.
По сравнению с другими опубликованных протоколов по3,22,23, наш протокол использует АБС битор РНКазы VRC во время пищеварения и более высокую концентрацию VRC во время гибридизации. Добавление VRC в этих двух шагов улучшить согласованность результатов smFISH, возможно, лучше сохранение молекулы РНК против нуклеиназы активности, который может быть представлен zymolyase смеси (фермент очищается от сырой экстрактов и может содержать РНКазы загрязнители). Таким образом мы рекомендуем использовать количество VRC, как указано в нашем протокола или даже более высокие концентрации VRC для оптимизации.
Значительная часть клетки могут быть потеряны во время стирки шаги в буфер B и формамид мыть буфера. Чтобы уменьшить потери клеток, одно может увеличить скорость центрифугирования. В нашем случае с помощью высокой скорости (21000 х g) гранул наши образцы во время буфера B моет значительно сокращена ячейка потерь. Однако клетки становятся очень хрупкие после zymolyase пищеварение, поэтому не рекомендуется изменять скорость центрифугирования. Вместо этого мы предлагаем использовать трубы низким сцеплением от научных США, которые значительно помочь Пелле клетки во время мойки в буфере мыть формамид. В целом наш протокол последовательно можно создать монослоя клеток достаточно плотная для эффективной визуализации. Как правило, должна принести 7 полей зрения > 130 клеток для количественной оценки.
И наконец важно определить оптимальные параметры для и мероприятий, от анализа изображений. Для обнаружения smFISH пятна, опубликованного анализа программы обычно фильтр изображений raw с использованием гауссовой ядра для удаления фонового сигнала и попросить пользователей, чтобы определить отношение сигнал шум, используемое для каждого набора изображений2,17. К сожалению в настоящее время не существует единого стандарта, в котором определяются соответствующие параметры, и поэтому некоторые эмпирические тестирование этих различных параметров является необходимым. Чтобы задать параметры, необходимые для каждого из этих шагов, необходимо итеративно ввода задать различные наборы параметров и проверить, насколько хорошо результаты, полученные от каждого набора совпадает с ручной подсчет в несколько представительных клеток. Как только один набор параметров найден, он может использоваться для большинства изображений, полученных несмотря на условия различных роста и генетических особенностей.
Кроме того можно проверить, если проекция максимальной интенсивности smFISH изображения может быть выполнена до количественная оценка22. Этот шаг упрощает месте обнаружения алгоритма и значительно сокращает время обработки изображений, хотя за счет некоторые потенциально полезную информацию об отдельных пятен, таких как их субцеллюлярные локализации. В нашем случае количество молекул мРНК, производимые NDC80 ген был достаточно низким, что пятна были хорошо разделенных после этой обработки (не редкость для стенограммы в многообещающий дрожжей3,7). В тех случаях, когда colocalization анализ критических анализ трубопровода необходимо определить местоположение каждого smFISH место в каждом канале, чтобы оценить colocalization. В зависимости от конкретных вопросов спрашивает, другие сведения, например интенсивности каждого пятна могут также должны быть извлечены из конвейера для дальнейшего анализа. Оптимизация ключевых шагов в протоколе и конвейер анализа изображения имеет решающее значение в получении высокое качество данных smFISH изучить вопрос о заинтересованности.

Динамический регуляцию экспрессии генов диски развития организма, а также его ответ на экологического стресса, инфекции и изменения в метаболизме. Исследования, которые сосредоточены на регуляцию полагаются на технологии, которые измеряют РНК изобилия. Один из таких методов, называемых одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH), используется для обнаружения отдельных молекул РНК в одиночных клетках1,2. Этот метод позволяет измерение к ячейке изменчивости в экспрессии генов и определение внутриклеточной локализации РНК.
В наиболее часто используемых smFISH технике обнаружения индивидуальных молекулы РНК требует несколько коротких ДНК зонды (часто ~ 48 20-mer зонды), которые дополняют цели РНК и сопряженных с же Люминесцентную краску. Связывание одного флуоресцентного зонда приводит слабый сигнал, но сигнал от ансамбля всех датчиков является надежной. Эта функция значительно улучшает отношение сигнал шум, потому что даже несмотря на то, что один зонд может exhibit-цели привязки, такой сигнал ожидается быть очень слабыми по сравнению с целевой молекулы РНК3. В ошибка обнаружения количество молекул РНК могут учитываться и сравнить между различными роста условиях и среди разных мутантов.
С момента своего первого развития smFISH была адаптирована для изучения различных аспектов генной выражение4, например транскрипции удлинение1,2, сплайсинга5,6, транскрипционный анализ разрыва7 , 8 , 9, внутриклеточный аллельные выражение10,11,12и РНК локализации13,14,15. Недавно, мы использовали этот метод для изучения экспрессии двух изоформ Стенограмма такого же гена, в котором изоформы краткое стенограммы (NDC80ORF) имеет свою всю последовательность, совместно с длиной изоформы (NDC80luti )16. Для уникальной идентификации две изоформы мРНК, мы использовали два датчика: один набор для уникальных последовательности NDC80luti, и другой набор, конъюгированных с другой Люминесцентную краску, привязывает к области общих двух изоформ. NDC80luti РНК определяется как colocalized пятно с обеих флуоресцентные сигналы, тогда как NDC80ORF РНК является тот, который содержит только сигнал от общего набора зонд. Так как количество NDC80ORF стенограммы вычисляется методом «вычитание», уверенно выявлять smFISH пятен и уменьшить ошибки необходимы высокая эффективность зонд гибридизации и высокое соотношение сигнал шум распространение.
Этот документ описывает оптимизированный протокол для выполнения smFISH в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этот протокол, мобильный номер, фиксации времени, время пищеварения, пищеварение буфер, зонд концентрации и гибридизации буфер, используемый для smFISH экспериментов были оптимизированы для SK1 штамм фон S. cerevisiae проходит вегетативной рост или мейоза. Однако мы также отмечаем в этой рукописи: (1) метод для проверки качества данных, smFISH после захвата изображений и (2 шаги в протоколе, которая может потребоваться дополнительная оптимизация для различных штамма стола и условий роста.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) – это мощный метод для изучения экспрессии генов в одиночных клетках из-за его способность обнаруживать и рассчитывать отдельные молекулы РНК. В дополнение к глубокие методы, основанные на последовательности, smFISH предоставляет сведения о вариации для ячеек в изобилии Стенограмма и внутриклеточных локализации данного РНК. Недавно мы использовали smFISH для изучения экспрессии гена NDC80 во время мейоза в многообещающий дрожжи, в котором два Стенограмма изоформ существуют и краткое стенограммы изоформы имеет свою всю последовательность, совместно с длиной изоформы. Чтобы уверенно идентифицировать каждый Стенограмма изоформы, мы оптимизирована известных smFISH протоколы и получили высокой согласованности и качества данных smFISH для образцов, приобретенных во время бутонизации дрожжей мейоз. Здесь мы опишем это оптимизированный протокол, критерии, которые мы используем для определения ли получено высокое качество данных smFISH и некоторые советы по реализации этого протокола в других штаммов дрожжей и условий роста.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Этот одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация протокол оптимизирован для подсчитать количество молекул РНК в многообещающий дрожжей во время вегетативного роста и мейоз.

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Одно Молекула Анализ лазерных локализованные псоральны аддукты

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...