Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Agradecemos a Anne Dodson y Stephanie Heinrich para consejos sobre cómo optimizar el protocolo de smFISH, Xavier Darzacq para ayudar con la plataforma de análisis, Haiyan Huang para sugerencias sobre el análisis estadístico. Este trabajo fue apoyado por fondos de March of Dimes (FY15-5-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) y Glenn Foundation a ésta y a NSF Graduate investigación beca Grant no. DGE-1106400 a JC.

Nota: Todos los buffers y los medios utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1. La información de proveedores para los reactivos se enumera en la Tabla de materiales.
Día 1/día 1-2:
Nota: Para el cultivo vegetal, cultivar células a un OD600 de 0.4 a 0.6 en un medio preferido. Para la cultura meiótica, inducir las células experimentan meiosis utilizando un método preferido (normalmente el cultivo en un OD600 de 1,85).
1. la fijación y la digestión de la muestra
<ol><li>Arreglar un total de ~3.5 OD600 de células en formaldehído al 3%.<ol>
<li>Para el cultivo vegetativo, añadir mL 5,52 de cultura a 480 μl de formaldehído al 37% en tubos cónicos de 15 mL.</li>
		<li>Para la cultura meiótica, añadir 1840 μl del cultivo a 160 μl de formaldehído al 37% en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Invertir aproximadamente 5 veces para mezclar. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los tubos en un tambor de rodillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para muestras meióticas, después de fijar a temperatura ambiente durante 20 minutos, continúan la fijación durante la noche a 4 ° c, rotación. Nota: La fijación durante la noche aumenta la reproducibilidad y la calidad de los datos smFISH obtenidos para las muestras meióticas. Tiempo de fijación debe ser optimizado.</li>
	<li>Mientras que la fijación de las muestras, descongelar 200 mM Vanadyl ribonucleósido complejos (VRC) a 65 ° c durante al menos 10 minutos.</li>
	<li>Preparar la mezcla principal de digestión en un tubo de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 425 μl de tampón B con 40 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c); para las 5 muestras, mezclar 2125 μl de tampón B con 200 μL de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c). Vórtice ~ 5 s para suspender de nuevo el VRC completamente antes de agregar a la mezcla principal, que aparecerá en verde marrón claro después de la adición de VRC. Nota: Además de VRC durante la digestión mejora la consistencia de los resultados de la smFISH, potencialmente inhibiendo el contaminante de nucleasa introducido por la mezcla de zymolyase, que es purificada del extracto crudo. La cantidad de VRC en este paso debe ser optimizada.</li>
	<li>Para las muestras vegetativas, centrifugar los tubos a ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para muestras meióticas (después de la fijación durante la noche), centrifugar a 21.000 x g durante 1,5 minutos decantar o aspirar el sobrenadante de residuos de formaldehído. Nota: Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío mediante pipeteo arriba y abajo o invertir los tubos y agitando para mezclar. Transferencia de muestras vegetativas a los tubos 2 mL después resuspension.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de tampón frío B.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos quitar la mayor parte del líquido por aspiración o mediante pipeteo, dejando atrás ~ 100 μl.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de frío tampón B. centrífuga a 21.000 x g durante 1,5 minutos aspirado el líquido completamente por vacío o por pipeteo.</li>
	<li>Resuspender las células en 425 μl de la mezcla principal de la digestión y brevemente vortex para suspender de nuevo. Añadir 5 μl de 100T zymolyase de 10 mg/mL a cada tubo. Nota: Vortex zymolyase cada vez antes de agregarlo a los tubos. Añadir zymolyase a cada tubo individualmente, en lugar de agregar a la mezcla principal. Ambos pasos ayudará a mantener consistencia entre tubos de digestión porque zymolyase se precipita rápidamente.</li>
	<li>Vórtice 2-3 s para mezclar. Colocar los tubos en un tambor de rodillo y digerir a 30 ° c durante 15-30 minutos. Células vegetativas y primeras etapas meióticas, generalmente tarda ~ 15 min, y profase meiótica y divisiones meióticas, tarda generalmente 30 min. Nota: Comprobar en el microscopio cada 5 min después de 15 min y parada la digestión cuando ~ 80% de las células aparecen no transparente y no refractiva. Partir de este punto, las células son muy frágiles. Manejar suavemente las células y evitar el uso de extracción con bomba aspirativa o vórtex.
</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el líquido completamente mediante pipeteo.</li>
	<li>Resuspender suavemente las células con 1 mL de tampón B mediante pipeteo arriba y abajo 1 - 2 veces a la mezcla.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 min líquido eliminar tampón B mediante pipeteo. Resuspender suavemente las células en 1 mL de etanol al 70% (diluida con agua libre de ARNasa).</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente por 3.5-4 horas.</li>
</ol>2. hibridación
<ol><li>Llevar formamida a temperatura ambiente (por alícuota de 50 mL, se tarda 30 min en baño de agua). Nota: No abra la botella de formamida hasta que la botella llegue a temperatura ambiente para evitar la oxidación de formamida. PRECAUCIÓN: La formamida es tóxico. Manipúlelo y deséchelo según las normas institucionales.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado 10% formamida en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire 500 μl de etanol al 70% mediante pipeteo. Pipetee suavemente arriba y abajo para resuspender las células restantes y luego se transfieren las células a los tubos de baja adherencia. Nota: Usando tubos de adherencia baja grandemente reduce pérdida de la célula durante lavados posteriores.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el etanol mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado 10% formamida y suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces para resuspender las células.</li>
	<li>Permitir a las células a reposar a temperatura ambiente unos 20 minutos mientras se prepara la solución de hibridación. Para la 1 muestra, mezcle 50 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 5 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 1 μl de cada sondeo (final de 200 nM). Para las 5 muestras, mezclar 250 μl de tampón de hibridación (Temp. ambiente), 25 μl de 200 mM VRC (calentado a 65 ° c) y 5 μl de cada sondeo (final de 200 nM).<ol>
<li>Descongelar el tampón de hibridación (congelado a-20 ° c) a temperatura ambiente antes de abrir el tubo para evitar la oxidación de formamida.</li>
		<li>Después de agregar el 200 mM VRC, vortex por 5-10 s antes de añadir las puntas de prueba, que se diseñado y adquirido comercialmente y reconstituido según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Si dos sondas Co incubadas, añadir 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #1, y 1 μl de la 1:10 dilución de la población de punta de prueba #2, para hacer una dilución final de ~ 1: 500 para cada sonda. La concentración necesaria para que la mejor relación de señal a ruido deben ser optimizado (ver la discusión para más detalles).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de hibridación a cada tubo. Película los tubos para mezclar.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c en un tambor de rodillo durante al menos 16 horas en la oscuridad.</li>
</ol>Día 2/día 3
3. lavado y proyección de imagen
<ol><li>Llevar formamida a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado 10% formamida (FWB) en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Retirar los tubos del tambor de rodillo y colocar en una caja cubierta de papel de aluminio para proteger de la luz.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante en residuos peligrosos por pipeteo.</li>
	<li>Resuspender en 1 mL de 10% FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g para 3 minutos Retire el sobrenadante de residuos peligrosos mediante pipeteo y dejar ~ 50 μl.</li>
	<li>Mientras tanto, preparar el DAPI/FWB en un tubo cónico de 15 mL: para la 1 muestra, mezclar 1000 μl de tampón de lavado 10% formamida con 1 μl de DAPI de 5 mg/mL. De 10 muestras, mezclar 10 mL de tampón de lavado 10% formamida con 10 μl de DAPI de 5 mg/mL. Resuspender en 1 mL de DAPI/FWB transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.</li>
	<li>Incubar a 30 ° c por 30 min (no gira) en la caja cubierta de papel de aluminio.</li>
	<li>Descongelar los reactivos anti-bleach en el hielo.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante totalmente mediante pipeteo. Si es necesario, Centrifugue nuevamente para eliminar todo el sobrenadante.</li>
	<li>Para las muestras que no son imágenes inmediatamente, Resuspender el precipitado en 50 μl de tampón de GLOX sin enzimas. Pipeta de arriba y abajo 3 - 4 veces para mezclar.<ol>
<li>Mantener todas las muestras unimaged en la caja cubierta de papel de aluminio a 4 ° c hasta que esté listo a la imagen. Cuando esté listo para la imagen, centrifugar las muestras a ~ 376 x g durante 2 min y retire completamente el sobrenadante mediante pipeteo. Resuspender en GLOX con enzimas como abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para las muestras que se va a examinar inmediatamente, agregar 15-20 μl de tampón GLOX con enzimas. Suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Nota: El volumen añadido puede variar dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula. Recomendamos Resuspender el pellet en 15 μl de tampón de GLOX con enzimas y comprobar la densidad de células en el microscopio. Si las células son demasiado densas (células agrupar uno encima del otro), añade tampón GLOX extra con las enzimas. Si las células son demasiado escasas, Centrifugue la muestra y eliminar ~ 5 μl de tampón.</li>
	<li>Pipeta de 5 μl sobre un cubreobjetos (18 mm x 18 mm, no. 1) y poner el cubreobjetos sobre un portaobjetos.</li>
	<li>Poner un trapo de laboratorio sobre el portaobjetos donde se coloca el cubreobjetos. Presione suavemente en el paño de laboratorio para establecer la diapositiva (debe ver salir líquido de los cuatro bordes del cubreobjetos).</li>
	<li>Transfiera el porta a la sala de microscopio en una caja cubierta por papel de aluminio.</li>
	<li>Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio con gran aumento (60-100 X) y alta apertura numérica. Nota: Para recoger el máximo número de fotones emitidos por las sondas smFISH, microscopios confocales no se recomiendan, como limitan significativamente la cantidad de luz a recoger. Aquí, los datos se recolectaron en un microscopio equipado con 100 X, objetivo 1.4 en NA, usando filtros de CY5 (EX632/22, EM679/34) reflejado en 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; y DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32-50% También se debe adquirir una imagen de referencia de campo brillante. Adquirir cortes de 15-25 con un tamaño de paso de 0.1-0.2 μm, de enteramente bajo el enfoque del campo de visión totalmente arriba, para asegurarse de que todos los puntos de RNA se contabilizan.</li>
</ol>4. Análisis de la imagen
<ol><li>Analizar los datos de smFISH con smFISH publicado las herramientas de análisis como el pescado-quant17 y StarSearch2, o con programas a medida, dependiendo de las necesidades exactas del experimento. Nota: Una tubería de buen análisis debe permitir a los usuarios determinar un umbral para separar los verdaderos puntos de RNA de los antecedentes y estadísticas, como las coordenadas X, Y y Z (opcionales) y la intensidad de cada punto, el número de puntos en cada celda de salida y posiblemente los parámetros como una manera de filtrar las falsas detecciones.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

El protocolo que presentamos se deriva de otros protocolos de smFISH publicadas de3,2,21,22,23y está específicamente optimizado para el fondo de la cepa de levadura SK1. Los parámetros optimizados incluyen el numero de celular, duración de la fijación, velocidad de centrifugación y duración, duración de digestión, tampón de digestión, concentración de sonda y tampón de hibridación. Otros parámetros como la temperatura de hibridación y duración no fueron optimizados. En esta sección, compartimos algunas notas que ayude a adaptar el presente Protocolo a cualquier fondo de la cepa de levadura y las condiciones de crecimiento de interés.
La pared celular de levadura de florecimiento es un gran reto contra la obtención de imágenes de alta calidad smFISH en levadura de florecimiento porque la pared celular previene la penetración de la sonda. Digestión incompleta de la pared celular por zymolyase conduce a ineficiente hibridación de las sondas y la alta variabilidad de célula a célula en la señal. Sin embargo, digestión excesiva puede hacer las células demasiado frágil, significativa pérdida de la célula durante los pasos de lavado y estallar durante la preparación de los portaobjetos para la proyección de imagen de la célula. Por lo tanto, es fundamental optimizar la duración de la digestión. Se recomienda llevar a cabo un experimento piloto smFISH por extracción de la misma muestra para diferentes cantidades de tiempo. En nuestro caso, obtuvimos los mejores datos de smFISH si nos detiene la digestión cuando no refractiva ~ 80% de las células. Por lo general, para la misma condición de crecimiento, diferentes cepas mutantes genéticas pueden ser digeridas con tiempos similares. Sin embargo, la duración de la digestión es diferente cuando se compara entre diferentes condiciones de crecimiento y diferentes etapas de la meiosis en levadura de florecimiento. Una vez que se determina el momento, la calidad de smFISH es reproducible. Nota que para cepas mutantes con pared celular defectuosa síntesis o composición, digestión puede completarse en menos de 15 minutos de uso de lotes diferentes de zymolyase puede cambiar también un poco el tiempo de digestión.
Concentración óptima de la sonda es necesario para lograr un alto cociente signal-to-noise. Hemos diseñado y había adquirido nuestras sondas smFISH comercialmente. Buenas sondas (a menudo 20-mers) deben tener un porcentaje de GC desde 35% hasta 45%, un espacio mínimo de 2 pares de bases entre las puntas de prueba y baja reactividad cruzada. Utilizamos un diseño de sonda basada en web del fabricante para generar una lista de las puntas de prueba, y si hay suficientes sondas a elegir, utilizamos el algoritmo BLAST en la base de datos del genoma de Saccharomyces para eliminar las puntas de prueba con más de 17 pares de bases superpuestas con otras regiones genómicas. Elegimos más Fotoestables colorante fluorescente (CAL Fluor 590) para el conjunto de sonda que recuece a la única región de NDC80luti (CF 590) porque en este sistema, el número de puntas de prueba que satisfacen todos los criterios anteriores (20 sondas) fue menor que la número mínimo recomendado por el fabricante (~ 25 sondas). Después de la reconstitución la solución de la sonda siguiendo las instrucciones del fabricante, hemos hecho un 1:10 dilución de la solución y la solución diluida en alícuotas de 5 μl a-20 ° c. Cada alícuota se utilizó solamente una vez. Para la optimización, uno debe hacer serie diluciones desde la 1:10 diluyeron solución y prueba de que la concentración produce la mejor relación señal a ruido. Le recomendamos una serie de diluciones de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 y 1: 2000 de la población original. En nuestro caso, un factor de dilución 1: 500 dio lugar a la mejor relación señal a ruido, para el CF 590 y Q 670 sistemas de sonda.
Tiempo óptimo de fijación también es crítico para el éxito smFISH en levadura de florecimiento. Encontró que la fijación durante la noche a 4 ° c, en lugar de fijación a temperatura ambiente durante 20 minutos, mejoraron significativamente la consistencia y calidad de los resultados smFISH para muestras meióticas. Aunque no hemos probado cómo la noche fijación pueda impactar las muestras vegetativas, fijación a temperatura ambiente trabajó bien para esta condición de crecimiento. Por lo tanto, para optimizar el protocolo de smFISH de nuevas cepas o condiciones de crecimiento, se recomiendan a partir de tiempo de fijación corto a temperatura ambiente y aumentar el tiempo de fijación si se encuentra la alta variabilidad de la señal.
En comparación con otros protocolos publicados3,22,23, nuestro protocolo utiliza el inhibidor de Rnasa VRC durante la digestión y una mayor concentración de VRC durante la hibridación. Además de VRC en estos dos pasos mejoraron la consistencia de los resultados de la smFISH, posiblemente mejor preservar las moléculas de ARN contra actividad nucleasa, que se pueden introducir por la mezcla de zymolyase (la enzima purificada de extractos crudos y puede contener Rnasa contaminantes). Así, se recomienda utilizar la cantidad de VRC que figuran en nuestro protocolo o incluso altas concentraciones de VRC para optimización.
Se puede perder una porción significativa de las células durante los pasos de lavado en tampón B y el tampón de lavado de formamida. Para reducir la pérdida de la célula, uno podría aumentar la velocidad de centrifugación. En nuestro caso, utilizando una velocidad alta (21.000 x g) a nuestras muestras de pellets durante el búfer B lava pérdida significativamente reducida de la célula. Sin embargo, las células se convierten en muy frágiles después de la digestión zymolyase, por lo que no se recomienda el cambio de velocidad de centrifugación. Por el contrario, se sugiere utilizar los tubos de baja adherencia de científicos de Estados Unidos, que sedimenten las células durante los lavados en el tampón de lavado formamida de gran ayudan. En general, nuestro protocolo puede generar constantemente una monocapa de células lo suficientemente densas para la proyección de imagen eficiente. Por lo general, deben producir los 7 campos de vista > 130 células adecuadas para la cuantificación.
Por último, es importante determinar los parámetros óptimos para el y los resultados de análisis de imagen. Para detectar manchas de smFISH, programas de análisis publicado comúnmente las imágenes raws usando kernel gaussiano para quitar la señal de fondo del filtro y preguntar a los usuarios a determinar la relación de señal a ruido para cada conjunto de imágenes2,17. Por desgracia, actualmente no existe una norma por la que se determinan los parámetros apropiados, y así algunas pruebas empíricas de estos ambientes son necesario. Para establecer los parámetros necesarios para cada uno de estos pasos, uno necesita iterativamente diferentes conjuntos de parámetros de entrada y compruebe qué tan bien los resultados obtenidos en cada juego del recuento manual en algunas células representativas. Una vez que se encuentra un conjunto de parámetros, puede ser utilizado para la mayoría de las imágenes obtenidas a pesar de diferentes condiciones de crecimiento y antecedentes genéticos.
Además, uno puede probar si proyección de máxima intensidad de las imágenes de smFISH puede llevarse a cabo antes de la cuantificación22. Este paso simplifica el algoritmo de detección de punto y significativamente reduce el tiempo de proyección de imagen, aunque a costa de información potencialmente útil sobre manchas individuales, tales como su localización subcelular. En nuestro caso, el número de moléculas de ARNm producidas por el gene de NDC80 fue lo suficientemente bajo como para que los puntos estaban bien separados después de este proceso (no es infrecuente para las transcripciones en florecimiento levadura3,7). En casos donde está crítico el análisis de colocalización, la tubería del análisis debe determinar la ubicación de cada punto de smFISH en cada canal para evaluar colocalización. Dependiendo de las preguntas específicas se pide, otros datos como la intensidad de cada punto también pueden necesitar ser extraído de la tubería para su posterior análisis. Optimización de la clave de los pasos en el protocolo y la tubería de análisis de imagen es crucial en la obtención de alta calidad de los datos smFISH para estudiar la cuestión de interés.

Regulación dinámica de la expresión génica impulsa el desarrollo de un organismo, así como su respuesta al estrés ambiental, infección y cambios en el metabolismo. Estudios que se centran en la regulación transcripcional se basan en tecnologías que miden la abundancia de RNA. Un tal método, denominado sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH), se utiliza para la detección individuales de moléculas de ARN en las células1,2. Este método permite la medición de la variabilidad de célula a célula en la expresión génica y la determinación de la localización intracelular de RNA.
En la técnica de smFISH más utilizados, la detección de una molécula de RNA individual requiere múltiples cortas sondas de ADN (a menudo ~ 48 20-mer sondas) que son complementarios en el destino del RNA y se conjugan en el mismo tinte fluorescente. Fijación de una sola sonda fluorescente resulta en una señal débil, pero la señal desde el conjunto de todas las sondas es robusta. Esta característica mejora considerablemente la relación señal a ruido porque a pesar de una sola punta de prueba puede exhibir objetivo vinculante, tal señal se espera que sea muy débil en comparación con el objetivo de la molécula de RNA3. Dentro de error de detección, el número de moléculas de ARN puede ser contado y comparado en diferentes condiciones de crecimiento y entre mutantes diferentes.
Desde su primer desarrollo, smFISH ha sido adaptado para estudiar diversos aspectos de la gene expresión4, tales como transcripción elongación1,2,5,6, transcripcional estallar7 de empalme , 8 , 9la expresión alélica intracelular10,11,12y RNA localización13,14,15. Recientemente, hemos utilizado este método para estudiar la expresión de ambas isoformas de la transcripción del mismo gen, en la que la isoforma corta transcripción (NDC80ORF) tiene su secuencia de todo comparte con la isoforma larga (NDC80luti )16. Para identificar de forma única las dos isoformas mRNA, utilizamos dos tipos de sonda: un sistema es específico de la secuencia única de NDC80luti, y el otro conjunto, conjugado a otro colorante fluorescente, se une a la región común de las dos isoformas. NDC80luti RNA es identificado como un lugar colocalized con ambas señales fluorescentes, mientras que el NDC80ORF RNA es la que contiene sólo la señal desde el conjunto de sonda común. Dado que el número de la NDC80ORF transcripciones se calcula por un método de "resta", alta eficiencia de la hibridación de la sonda y un alto cociente signal-to-noise son necesarios para identificar puntos de smFISH con confianza y reducir el error propagación.
Este papel describe un protocolo optimizado para realizar smFISH en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. En este protocolo, numero de celular, tiempo de fijación, tiempo de digestión, tampón de digestión, concentración de la sonda e hibridación buffer utilizado para los experimentos de smFISH fueron optimizados para el SK1 cepa fondo de S. cerevisiae que vegetativo crecimiento o la meiosis. Sin embargo, también observamos en este manuscrito: (1) el método para comprobar la calidad de los datos de smFISH después de la adquisición de la imagen y (2) los pasos en el protocolo que requieran optimización adicional de tensión diferentes orígenes y condiciones de crecimiento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Sola molécula en situ hibridación de la fluorescencia (smFISH) es una técnica poderosa para el estudio de expresión génica en las células debido a su capacidad para detectar y contar las moléculas de ARN individuales. Complementaria a métodos basados en la secuenciación profunda, smFISH proporciona información sobre la variación de célula a célula en abundancia de la transcripción y la localización subcelular de un determinado RNA. Recientemente, hemos utilizado smFISH para estudiar la expresión del gene de NDC80 durante meiosis en levadura de florecimiento, en que dos transcripción existen isoformas y la isoforma corta transcripción tiene su secuencia todo comparte con la isoforma larga. Para identificar con confianza cada isoforma de transcripción, conocido smFISH protocolos optimizados y obtuvo alta consistencia y calidad de los datos smFISH para las muestras que se adquirieron durante el florecimiento levadura meiosis. Aquí, describimos este protocolo optimizado, los criterios que utilizamos para determinar si se obtiene alta calidad de los datos de smFISH y algunos consejos para la aplicación de este protocolo en otras cepas de levadura y las condiciones de crecimiento.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Esta sola molécula fluorescencia en situ hibridación protocolo está optimizado para cuantificar el número de moléculas de ARN en levadura de florecimiento durante la meiosis y crecimiento vegetativo.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

The overall goal of this optimized single molecule RNA in situ hybridization, or smFISH, is to detect and quantify individual RNA molecules on a per cell basis during the vegetative growth and meiosis of budding yeast. This method reveals cell to cell variability in gene expression on subcellular RNA localization and is therefore a powerful technique to study gene regulation. Asides from the unique information that can be revealed by smFISH, the main advantage of the technique is that once optimized, it's robust and highly reproducible.A meiotic culture will be used for the demonstration of this protocol. To fix the culture in 3%formaldehyde, add 1840 microliters of the culture to 160 microliters of 37%formaldehyde in a two milliliter microcentrifuge tube. Invert about five times to mix.Place the tube on a roller drum at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, continue fixing at four degrees Celsius with rotation overnight. On the following day, prepare for the digestion by first thawing 200 millimolar vanadyl ribonucleoside complexes, or VRC, at 65 degrees Celsius for at least 10 minutes.To prepare the digestion master mix, first pipette 2125 microliters of buffer B into a 15 milliliter tube. Then vortex the warm VRC for five seconds to fully resuspend it and add 200 microliters of VRC to the 15 milliliter tube. The mix should appear light brownish green in color.Centrifuge the meiotic sample at 21, 000 x g for one and a half minutes at room temperature. Aspirate the supernatant carefully, placing the vacuum tip on the opposite side of the pellet to avoid disturbing the pellet. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B by pipetting up and down to mix.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Remove the bulk of the liquid by vacuum aspiration, leaving behind about 100 microliters. Resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B.Centrifuge the samples, remove the liquid, and resuspend the cells in one and a half milliliters of cold buffer B again.Centrifuge at 21, 000 x g for one and a half minutes. Aspirate the liquid completely by pipetting. Resuspend the cells in 425 microliters of digestion master mix and vortex briefly.Add five microliters of zymolyase to the tube and vortex for two to three seconds to mix. Place the tube on a roller drum and digest at 30 degrees Celsius for 15 to 30 minutes. After 15 minutes, check the cells by microscopy every five minutes and stop the digestion when about 80%of the cells appear non-transparent and non-refractive.Centrifuge the tube at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant completely. Gently resuspend the cells with one milliliter of buffer B by pipetting up and down one to two times to mix.Centrifuge the tube and remove the buffer. Gently resuspend the cells in one milliliter of 70%ethanol and incubate at room temperature for three and half to four hours. To begin the hybridization procedure, centrifuge the tube of cells at 376 x g for three minutes.Remove 500 microliters of the 70%ethanol from the tube. Gently pipette up and down to resuspend the remaining cells and transfer the cells to a low adhesion tube. Transferring the sample to a low adhesion tube is critical for preventing excess cell loss during the subsequent formamide washes.Centrifuge the low adhesion tube and remove all the ethanol. Add one milliliter of 10%formamide wash buffer to the tube and gently pipette up and down two to three times to resuspend the cells. Allow the cells to set at room temperature for about 20 minutes while preparing the hybridization solutions, as described in the text protocol.Centrifuge the sample and remove the supernatant into hazardous waste. Add at least 50 microliters of each hybridization solution to the tube and flick the tube to mix. Incubate at 30 degrees Celsius on a roller drum for at least 16 hours in the dark.When the hybridization is complete, place the tube of cells into a foil covered box to protect from light. Centrifuge the sample at 376 x g for three minutes. Remove the supernatant into hazardous waste by pipetting.Resuspend the sample in one milliliter of 10%formamide wash buffer by gently pipetting up and down two to three times. Place the tube of cells back into a foil covered box to protect from light and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, centrifuge the sample.Remove the supernatant to hazardous waste by pipetting, leaving about 50 microliters. Resuspend the sample in one milliliter of DAPI solution by gently pipetting up and down two to three times. Once again, place the tube of cells into the foil covered box and incubate at 30 degrees Celsius for 30 minutes.Centrifuge the sample and remove the supernatant completely by pipetting. For samples that will not be imaged immediately, resuspend the pellet in 50 microliters of GLOX buffer without enzymes. Pipette up and down three to four times to mix.Keep in the foil covered box at four degrees Celsius until ready to image. For samples being imaged immediately, add 15 to 20 microliters of GLOX buffer with enzymes. Pipette five microliters onto a cover slip and put the cover slip on a slide.Place a laboratory wipe on top of the slide where the cover slip is placed. Gently press on the wipe to set the slide. Place the slide into a box covered by aluminum foil for transfer to the microscope room.This protocol was used to examine the expression of the NDC80 gene, which expresses two mRNA isoforms. The long undecoded transcript isoform has a 400 base pairs five prime extension in comparison to the short isoform. Two sets of probes were designed.The CF 590 set binds to the unique five prime region of the long isoform, and the Q 670 set binds to the common region of both isoforms. Under optimized conditions, distinct smFISH spots were clearly identified for both probe sets. The two probe sets were used to study NDC80 expression during vegetative growth and meiosis.In vegetative cells, robust signal from the Q 670 probe set was detected, but not from the CF 590 probe set. In contrast, robust signal from both probe sets was detected in meiotic prophase, and the majority of the spots had co-localized signal. Northern blot analysis confirmed that the long isoform was expressed specifically in meiosis.Vegetative cells were found to have a median of five short isoform transcripts per cell, whereas in meiotic prophase cells, the median significantly dropped to four transcripts per cell. In meiotic prophase, the median number of long isoform transcripts per cell was 21 and 100%of the cells expressed the transcript. Once mastered, this technique can be done in 72 hours if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to first optimize the digestion duration and a concentration of smFISH probes required to achieve the optimal signal to noise ratio. In addition, remember to add VRC during digestion and overnight hybridization to prevent nuclease activity. With this development, this technique paved the way for researchers to explore dynamic gene regulation and subcellular RNA localization.After watching this video, you should have a good understanding of how to perform single molecular RNA FISH in budding yeast meiosis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Investigación

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

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Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

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MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...