Name: single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

نود أن نشكر إيمي بوغ برنار لها مساهمات فكرية وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل ووارنج "بوتشير مؤسسة ويب جائزة البحوث الطبية الحيوية" عدد K23-1K23AR070897 من المعاهد الوطنية للصحة لايلينا W.Y. هسيه. كما أيدها عدد جائزة K12-HD000850 من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وولوسيل باكارد لصحة الأطفال، وجامعة ستانفورد كتسا UL1 TR001085، وأبحاث صحة الطفل جامعة معهد ستانفورد.

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بولاية كولورادو متعددة المؤسسية استعراض المجلس (كوميرب) من جامعة كولورادو. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم ينص على خلاف ذلك، مع نصائح الماصة التي تمت تصفيتها، وتصفية جميع المواد الكاشفة.
<p class="jo...

<ol>
	<li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+diseases:+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States.">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li><li>Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus:+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s.">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li><li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).</li><li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+effector+CD4++T+cells.">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 11 (6), 257 (2009).</li><li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function:+the+T+helper+type+17+example.">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li><li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+stories+on+Th17+cells.">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li><li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry.">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum.">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li><li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry:+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li><li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li><li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li><li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients.">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li><li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li><li>Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

هنا يصف لنا الرواية، خلية واحدة، نهج البروتين لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. يستخدم هذا الأسلوب الدم كله الطرفية كأداة تحليلية، والخلوي الشامل كأداة لتقييم المناع?...

أمراض المناعة الذاتية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات التي تؤثر على 3-8 في المائة من السكان. في الولايات المتحدة، اضطرابات المناعة الذاتية من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بين الشباب ومتوسطي العمر النساء (الإعمار < 65 سنة)1،2. اضطرابات المناعة الذاتية تتميز بعرض السريرية غير متجانسة والعمليات المناعية الأساسية المتنوعة. كذلك تمثل الطيف من عدم التجانس عبر الاضطرابات المختلفة، مثل مشاركة المشترك في التهاب المفاصل الرثياني (RA) والأمراض العصبية في التصلب المتعدد (MS). ومع ذلك، يتمثل هذا المستوى من عدم التجانس أيضا داخل اضطراب واحد، مثل الذئبة الحمامية الجهازية (SLE): يجوز تقديم بعض المرضى بأمراض الكلي، بينما يعاني الآخرون من مشاركة الدموية أو المشتركة3.
إيمونوباثوجينيسيس الكامنة في اضطرابات المناعة الذاتية مرايا التغايرية السريرية، التي تشمل وفرط-التنشيط التلقائي لعدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية الفطرية والتكيف، وإنتاج سيتوكين dysregulated المصاحبة. بينما السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية، فهم دورها المحدد في إليه المرض ثبت أن التحدي. تتميز السيتوكينات pleiotropy (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار متعددة على أنواع مختلفة من الخلية)، التكرار (السيتوكينات متعددة يمكن أن يكون نفس التأثير)، وازدواجية (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار برو أو مكافحة inflammatory تحت ظروف مختلفة)، واللدونه (يمكن أن يكون مصبوب السيتوكينات في دوراً مختلفاً عن واحدة "الأصلي"، اعتماداً على البيئة)4،،من56. ونتيجة لذلك، لا يميز أساليب السكان مستوى الاستجابات الخلوية غير المتجانسة لنفس "سيتوكين الوسط". وبالمثل، لا تقدم تصاميم الدراسة التي تركز على جانب واحد من جوانب محددة في الجهاز المناعي (نوع وحيد الخلية أو سيتوكين)، تقييما شاملا لجميع العناصر المتورطة في أمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة.
مؤخرا، طورنا نهجاً البروتين وحيد الخلية تقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. سير العمل الموضحة هنا يتسم باستخدام عينات الدم كله الطرفية سليمة، بدلاً من خلايا الدم المحيطية المنعزلة وحيدات النوى (ببمكس). الدم كله هامشية تمثل المركبة الأكثر فسيولوجيا ذات الصلة لدراسة المرض المناعي بوساطة النظامية، بما في ذلك خلايا الدم 1) غير-وحيدات النوى غالباً ما تشارك في أمراض المناعة الذاتية (أي، العَدلات، والصفائح الدموية)، و 2) البلازما تعميم العوامل، مثل الأحماض النووية ومجمعات محصنة السيتوكينات، التي لها أدوار تفعيل المناعة. للقبض "الجوهرية المسببة للأمراض" إنتاج سيتوكين dysregulated، الدم المحيطي معالجة العينات مباشرة بعد سحب الدم (T0، الساعة الصفر)، وبعد ح 6 من الحضانة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الفسيولوجية) مع نقل بروتين المانع في غياب أي شرط تحفيز خارجية (T6، ح 6 الوقت)، للكشف عن إنتاج سيتوكين (تراكم، T6-T0) التي تعكس حالة المرض "الجوهرية" (الشكل 1). دراسة العمليات dysregulated التي تعكس مدى أو التنشيط الناقص من إشارات سبل المشاركة في الاستجابات المناعية ذات الصلة بالمرض، وعينات الدم المحيطي تعامل (ح 6 الحضانة عند 37 درجة مئوية مع مثبط نقل بروتين) مع خارجية حفز شرط أن يعكس منشأ المرض، مثل عدد القتلى-مثل-مستقبلات (TLR) يضع في حالة الذئبة الحمامية المجموعية (T6 + R848، الساعة 6 ح مع 1 ميكروغرام/مل R848)، للكشف عن إنتاج سيتوكين التي تعكس استجابة للأحماض النووية (مقارنة T0 مقابل T6 مقابل T6 + R848، الشكل 1). دراسة الآثار إيمونومودولاتوري للعلاجات المتاحة السابقين فيفو، كما أنها تتصل بالعمليات الدقيقة dysregulated المناعة للمرضى محددة، يتم التعامل مع عينات الدم المحيطي مع مثبط جاك في ذات الصلة تكون العلاجية تركيز (هنا، 5 أم روكسوليتينيب؛ T6 + 5R، الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، للكشف عن التغييرات في حالة المرض "الجوهرية" في الاستجابة للدواء (T0 مقابل T6 مقابل T6 + 5R، الشكل 1). وقد اختير مثبط جاك لهذه الدراسة لمثبطات جاك قد ثبت نجاحها في علاج أمراض المناعة الذاتية مثل رع.
في نفس الوقت تقييم dysregulated العمليات الوارد وصفها أعلاه في متعددة الخلايا المناعية مجموعات فرعية، عينات الدم المحيطي من الذئبة الحمامية المجموعية معالجتها كما هو موضح أعلاه وتحليلها بواسطة الخلوي الشامل المرضى وضوابط صحية. الشامل الخلوي، المعروف أيضا قياس الوقت-الطيران، يقدم التحليل خلية واحدة من المعلمات ما يزيد على 40 دون تداخل القضايا الطيفي7،،من89. ويستخدم هذا الأسلوب نظائر المعادن الأرضية النادرة في شكل أيونات المعادن القابلة للذوبان كعلامات ملزمة للأجسام المضادة، بدلاً من فلوروفوريس10. ويمكن الاطلاع على تفاصيل إضافية فيما يتعلق بمنصة تكنولوجية الخلوي الشامل (أي ضبط ومعايرة، والحصول على عينة) في Leipold et al. ومكارثي et al. 11 , 12 العالية-أبعاد للخلوي الشامل تمكن قياس السيتوكينات متعددة في جميع أنحاء الخلية المناعية الفطرية وتكيفية مجموعات فرعية متزامنة مع خلية واحدة الحبوبية (جدول المواد).
معلمات السريرية والمختبرية التقليدية الحالية غالباً ليست حساسة أو محددة بما يكفي للكشف عن نشاط المرض الجارية أو الرد على إيمونومودولاتورس محددة13، مما يعكس الحاجة إلى ترسيم أفضل المناعة الكامنة التغييرات التي تدفع تفجر. نظراً لانتشار التقلبات سيتوكين في أمراض المناعة الذاتية، وقد حشدا نهج العلاج باستخدام الأجسام المضادة أو مثبطات الجزيئية صغيرة تستهدف السيتوكينات أو إشارات البروتينات المشاركة في تنظيم إنتاج سيتوكين ظهرت مؤخرا. في شكله الأساسي، النهج التحليلي الدم المحيطي الموصوفة هنا منبرا لتحديد مجموعات فرعية خلية dysregulated الخاصة بالمريض وإنتاج سيتوكين غير طبيعي في أمراض المناعة الذاتية مع مظاهر جهازية. تسمح هذه المنهجية لتخصيص الخيارات العلاجية كما يمكن التعرف على السيتوكينات dysregulated محددة، ومعاملة محددة يمكن أن تكون خيارات اختبار فيفو السابقين لتقييم قدرتها على إيمونومودولاتي المرض محددة المريض عملية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية. ومن ثم تم قياس مستويات سيتوكين تركيز دراسات متعددة في محاولة لفهم آليات محددة تؤدي إلى انهيار سيلفتوليرانسي والمناعة الذاتية اللاحقة. النهج حتى الآن قد تم استناداً إلى دراسة جانب محدد من الجهاز المناعي (واحد أو بعض أنواع الخلايا أو السيتوكينات)، ولا توفر تقييما شاملا لأمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة. اتباع نهج شامل في خلية واحدة لتقييم إنتاج سيتوكين في عدة مجموعات فرعية في الخلايا المناعية، في سياق "الجوهرية" الخاصة بالمريض البلازما تعميم العوامل، يرد هنا. هذا النهج يتيح رصد النمط الظاهري المناعي الخاصة بالمريض (علامات السطحية) والدالة (السيتوكينات)، أما لأن أصلي "الجوهرية المسببة للأمراض" مرض الدولة، أو في وجود العوامل العلاجية (في فيفو أو السابقين فيفو).

الشكل 1 يوضح سير العمل للتحفيز وتجهيز عينات الدم المحيطية، بما في ذلك تخصيص مختبرين عينة الدم، النقل توقيت إضافة عوامل التحفيز، بروتين مثبط كوكتيل، والحضانة مرات حتى تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) والتثبيت. وسيتوقف اختيار عوامل حفز على مسارات الإشارات وسيت?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

This method can help answer questions in the autoimmunity field such as identifying cell frequency abnormalities and function differences such as production of key cytokines in the setting of autoimmune disease. The main advantage of this method is that it can capture a broad repertoire or different cell types and function differences from a easily obtainable peripheral blood sample. Generally, individuals new to this process may struggle with getting the timing of the blood processing steps right, the antibody panel design, the barcoding process itself, and analysis of high dimensional single cell data.This systems immunology approach is particularly suitable for autoimmune diseases like SLE where immune dysregulation is pervasive and evident in peripheral blood. Visual demonstration of this method is important to clarify the timing of steps and also to show how multiple samples can be barcoded and pooled prior to mass cytometry analysis. To begin this procedure, place the labeled round bottom polystyrene tubes of five different conditions for whole blood processing on a rack.Next, add one milliliter of 37 degree Celsius RPMI to each tube. Then, add one milliliter of whole blood to each tube and pipette up and down several times to mix thoroughly with RPMI. Subsequently, add 10 microliters of pre-diluted ruxolitinib to the tube labeled T six plus five R and mix thoroughly.Place the rack of tubes in the incubator at 37 degrees Celsius and begin timing the incubation. To process the T zero sample, pipette the entire content of the T zero tube into a labeled conical tube containing 20 milliliters of 37 degree Celsius lyse/fix buffer at working concentration. To optimize cell recovery, rinse the tube with lyse/fix buffer and mix by inverting the conical tube.Incubate the cells at 37 degrees Celsius for 15 minutes to allow for lysis and fixation. Then, centrifuge the cells at 500 times G for five minutes at room temperature. Afterward, decant the supernatant and re-suspend the cells in one milliliter of ice cold PBS to break up the pellet.Then, fill the conical tube to a 15 milliliter volume with PBS. Subsequently, centrifuge the cells at 500 times G for five minutes at room temperature. Re-suspend the cells in one milliliter of CSM to break up the pellet.Then, transfer the sample to a labeled microcentrifuge tube for antibody staining. Using an automated cell counter, count the cells with a 10 microliter sample. Next, centrifuge the cells at 500 times G for five minutes at room temperature.Afterward, aspirate the supernatant, leaving the pellet in about 60 microliters of residual. Keep this pellet on ice until the samples from other conditions have completed processing. At T equals 30 minutes, transfer the tube rack to the tissue culture hood.Add 10 microliters of R848 at 0.1 grams per microliter to the T six plus R848 tube and mix thoroughly. Then, add 10 microliters of LPS at 0.01 micrograms per microliter to the T six plus LPS tube and mix thoroughly. Afterward, add four microliters of protein transport inhibitor to the tubes labeled T six, T six plus five R, and T six plus LPS and return the samples to the incubator until T equals six hours.Mix the samples thoroughly with a P1000 pipette every two hours. At T equals two hours, add four microliters of protein transport inhibitor cocktail to the T six plus R848 tube. Mix all samples and return the rack to the incubator until T equals six hours.At T equals four hours, mix the samples with a P1000 pipette one more time. At T equals six hours, process T six, T six plus LPS, T six plus R848, and T six plus five R blood sample tubes as described for the T zero sample. Then, store the pellets in residual CSM volume at minus 80 degrees Celsius to process later.To barcode the lysed, fixed cells, thaw the samples from the minus 80 degrees Celsius storage slowly on ice. Dilute the 10X barcoding perm buffer with PBS by one to 10 and make enough buffer for three milliliters per sample. Fill one non-sterile trough with CSM and one with the one X barcoding perm buffer.Then, add one milliliter of ice cold CSM to the freshly thawed samples, mix thoroughly, and transfer to the respective pre-labeled polypropylene cluster tubes. Now, take a 10 microliter sample and count the cells using an automated cell counter. Normalize the cell counts in each cluster tube by removing the volume of excess cells.Then, centrifuge the cells at 600 times G for five minutes at room temperature. Re-suspend the cells in one milliliter of one X barcoding perm buffer with a multichannel pipette and centrifuge at 600 times G for five minutes at room temperature. Afterward, aspirate off the supernatant.Line up the cluster tubes on a rack in the same order as indicated on the barcode key so the sample matches with its barcode. Add 800 microliters of one X barcoding perm buffer by multichannel pipette to all samples in the cluster tubes without touching the cell pellet to reduce cell loss. Then, set aside the rack with the cluster tubes.Remove the 20-plex palladium barcoding kit tube strips from minus 20 degrees Celsius and thaw at room temperature. Add 100 microliters of one X barcoding perm buffer, mix thoroughly, and transfer 120 microliters of the re-suspended barcode mix into the corresponding cell samples in the cluster tubes. Mix thoroughly by multichannel pipette so that there is no cross-contamination between individually barcoded samples.Incubate cluster tubes for 30 minutes at room temperature to allow the barcodes to label the cells. After 30 minutes, centrifuge the samples at 600 times G for five minutes at room temperature. Aspirate the supernatant, then re-suspend them in one milliliter of CSM.Subsequently, centrifuge and re-suspend in CSM again. Afterward, centrifuge at 600 times G for five minutes at room temperature and aspirate the supernatant. With a single pipette and using the same tip, transfer all cell pellets in about 70 to 80 microliters of residual volume to one polystyrene tube.Do not eject the pipette tip. Set aside the single pipette with this tip. With a multichannel pipette and new tips, add 100 microliters of CSM to each original cluster tube to maximize cell recovery.Using the single pipette with the tip that was set aside, transfer all cell pellets in 100 microliters of residual volume to the same polystyrene tube. Add CSM to top off the polystyrene tube to about three milliliters. Count and record the cell number of the pooled barcode set.Then, centrifuge at 600 times G for five minutes at room temperature and aspirate the supernatant. Proceed to staining the barcoded samples on the same day. This schematic demonstrates the workflow for the stimulation and processing of the peripheral blood samples, including allocation of blood sample aliquots, timing of the addition of stimulation agents, protein transport inhibitor cocktail, and incubation times until the red blood cell lysis and fixation.The choice of stimulating agents will depend on the signaling and cytokine pathways that are targeted for assessment. Following fixation and RBC lysis, the individual lysed, fixed cell samples from a healthy donor were barcoded, labeled with 26 antibodies against surface markers, permeabilized, and stained with 14 antibodies against cytokines. The limited gating strategy representing the identification of CD14 high monocytes is shown here.From left to right, each 2D plot represented is a population subset from the parent population that is gated from the 2D plot immediately to the left. Using CD14 high monocytes as representative in eight immune cell subsets, a mass cytometry analysis was performed on peripheral blood samples from a healthy donor at time zero unstimulated and following stimulation with TLR agonist LPS and R848 and the T-cell activator PMA ionomycin. An example of the cytokine induction in CD14 high monocytes is shown and selected cytokines with specificity to the stimulating agent used are depicted.R848 selectively induces IL-12p40 subunit and MCP1 in CD14 high monocytes while LPS does not. In contrast, PMA ionomycin does not induce cytokines in CD14 high monocytes. Once mastered, the blood stimulations can be done in about seven hours and the barcoding step can get done in just about an hour.When attempting this procedure, it's important to be mindful of the timing of the steps and to plan ahead accordingly. Once you have this procedure in place, you can consider altering the blood stimulation conditions in the mass cytometry panel in order to assess the immune cell responses that are specific to your own research aims. After watching this video, you should have a good understanding of how to elicit cytokine responses from whole blood samples and how to pool multiple samples into a barcoded set for mass cytometry analysis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...