Name: a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal National chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFA0104604), il programma generale della Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (NSFC, 81772093), la scienza e la tecnologia di sviluppo programma di Suzhou (ZXL2015128), la Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20161241) e un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono state gestite secondo le direttive del Comitato di etica di ricerca umana dell'istituzione (NO.2015120401, Data: 12 maggio 2015).
1. preparati
<ol><li>Tessuti di pelle addominale adulto fresca raccogliere scartati dalla chirurgia plastica presso l'ospedale in un tubo da 50 mL con 10 mL di Dulbecco ghiacciata s modified medium di Eagle (DMEM). I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 72 ore senza alterare significativamente l'attu...

<ol>
	<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis.">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).</li><li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal,+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin.">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+of+the+skin.">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (S1), S2 (2013).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing.">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li><li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells.">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li><li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture.">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv f&#252;r dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Rho-associated+protein+kinase+(ROCK)+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells.">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+human+epidermal+keratinocytes.">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin).">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cornified+envelope:+a+model+of+cell+death+in+the+skin.">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li><li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells.">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li><li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior.">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li></ol>

Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell'epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriv...

L'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle1,2,3, 4. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pelle danneggiata e nella terapia genica per applicazioni cliniche5,6. La questione chiave per le applicazioni basate su HKC è efficacemente isolare ed espandere i grandi numeri di HKCs con alto potenziale in vitro7,8. Anche se vari gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per produrre colture di staminali-simili HKCs, questi metodi sono a volte lungo e complicato per eseguire ed avere altre limitazioni, come cella bassa resa ed essere limitato dal tipo di esemplare della pelle usato9. Per esempio, il metodo tradizionale per isolare HKCs dai tessuti della pelle comporta una digestione enzimatica in due fasi con una separazione dell'epidermide dal derma6. Tale metodo di solito funziona bene per tessuti neonatale, ma diventa molto difficile quando utilizzato per isolare le cellule da tessuti adulti.
Y-27632, un inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK), è stato segnalato per migliorare significativamente l'efficienza della cellula staminale epidermica isolamento e Colonia crescita10,11,12. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che Y-27632 facilita la crescita clonale delle cellule epidermiche, ma riduce il rendimento delle cellule dermiche differenzialmente controllando l'espressione di molecole di adesione13. Inoltre abbiamo stabilito un nuovo medium condizionato di inoculazione, chiamato G-medio, che sostiene la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie. Dalla combinazione di G-medio con Y-27632, questo metodo novello può separare spontaneamente le cellule epidermiche e cutanee dopo digestione degli enzimi, eliminando in tal modo il passaggio di epidermide-derma separazione13,14. Basato su rapporti precedenti, ora descriviamo la procedura dettagliata di questo nuovo metodo per isolare HKCs dal tessuto pelle adulta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1344px;" width="1342">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:263px;">Countess automated cell counter</td>
			<td style="width:291px;">Invitrogen Inc.&#160;</td>
			<td style="width:264px;">C10227</td>
			<td style="width:527px;">Automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Electronic Scale</td>
			<td>Harbin Zhonghui</td>
			<td>1171193</td>
			<td>For tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">50ml Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science&#160;</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Defined K-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10785-012</td>
			<td>Epidermal cells culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For HKC dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">0.25% Trypsin&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td>T1350-100</td>
			<td>For HKC dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Coating Matrix Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td>For coating matrix</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">F12 Nutrient Mix, Hams</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31765035</td>
			<td>Component of G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FGF-2 Millipore</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>341595</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td>Preparation for G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NC9864731</td>
			<td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td>
			<td>Hewlett-Packard Development Company</td>
			<td>MA-20142</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Rabbit Anti-Human Loricrin</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-145p</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Mouse anti-human Vimentin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3390</td>
			<td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Integrin &#945;6(GOH3)</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-19622</td>
			<td>flow cytometry analysis of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:263px;">Rat IgG2a FITC</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-2831</td>
			<td>negative control antibody of &#945;6-integrin&#160; in flow cytometry analysis&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell'epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell'adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.

Diagrammi schematici del nuovo metodo (Figura 1A) e il metodo convenzionale (Figura 1B) sono presentati nella Figura 1. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi, che richiede una procedura di 2 giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione di One-Step, che dura circa 3 ore per eseguire. Cosa importante, il nuovo metodo di One-Step può ottenere due popolazioni (cellule epidermi...

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A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

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